中越金柑種質(zhì)資源的ISSR分析

1、中越金柑種質(zhì)資源的ISSR分析論文摘要：用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了25份其中102條具有多態(tài)性，多態(tài)性帶比率為85%。用UPGMA軟件進(jìn)行聚類分析，25份金柑種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.48-0.99之間，在遺傳系數(shù)為0.85水平處將25份供試資源劃分為8類，對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行分析。中越邊境野生山桔 Shanju 中越邊境 Sino-vietnamese border 12 誘變金柑1號(hào) Youbianjingan1 廣西大學(xué) Guangxi University 13 誘變金柑2號(hào) Youbianjingan2 廣西大學(xué) Guangxi University 14 四季桔 Calamondin

2、 廣西大學(xué) Guangxi University 15 越南金柑1號(hào) Yuenanjingan 1 越南 Vietnam 16 越南金柑2號(hào) Yuenanjingan 2 越南 Vietnam 17 越南金柑3號(hào) Yuenanjingan3 越南 Vietnam 18 越南金柑4號(hào) Yuenanjingan4 越南 Vietnam 19 越南金柑5號(hào) Yuenanjingan5 越南 Vietnam 20 越南金柑6號(hào) Yuenanjingan6 越南. Vietnam 21 寧波羅紋 F.japonica Swingle 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 Citrus Research Instit

3、ute, CAAC(Chinese Academy of Agricultural Sciences) 22 福建金豆 Fhindsii var.Chinton 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 Citrus Research Institute, CAAC 23 金豆 Fhindsii var.Chinton 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 Citrus Research Institute, CAAC 24 金豆 Fhindsii var.Chinton 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 Citrus Research Institute, CAAC 25 金豆 Fhindsii var.Chinton 中國農(nóng)

4、業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 Citrus Research Institute, CAAC 1.2方法采健康幼嫩的葉片，用改進(jìn)CTAB法提取金柑葉片基因組DNA，用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度與純度。最后將DNA稀釋至50ng-L，于-20冰箱備用。本試驗(yàn)選用的100條ISSR引物由上海生物工程合成，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)篩選出10條多態(tài)性較好的引物用于供試種金柑質(zhì)資源遺傳多樣性分析。采用以下優(yōu)化后的反響體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：DNA(50ng-L)1.0L、10 xbuffer(含Mg)2.0l、4.0mmol/LdNTP0.5L、30mol/L引物1l、DNA聚合酶(2.5U-L)

5、0.4L，加水至20L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性4min；94變性50s，復(fù)性退火溫度1min，72延伸2min，循環(huán)35次；72延伸7min。擴(kuò)增反響結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中參加4l溴酚藍(lán)混勻，取8l擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電極緩沖液為1xTAE，EB染色，拍照。譜帶記錄以電腦記錄的熒光條帶為依據(jù)，有條帶那么多態(tài)性記為l;，空缺時(shí)記為0;，把得到的0，1矩陣輸人NTsys2.10e，用NTsys2.10e軟件計(jì)算遺傳相似性系數(shù)，并用UPGMA程序構(gòu)建聚類圖。2結(jié)果與分析2.1引物篩選及ISSR-PCR多態(tài)性分析從100條ISSR引物中篩選出10個(gè)條帶清晰多態(tài)性好、比擬穩(wěn)定的引物，

6、用其對(duì)所有供試資源進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出120條帶，其中具有多態(tài)性的共102條，多態(tài)性比率為85%。平均每條引物可獲得12條帶，平均多態(tài)性條帶為10.2條 Primer Sequences 5-3 No. of securable bands No. of polymorphic bands Percentage of polymorphic loci(%) U807 (AG) T 12 10 83 U808 (AG) 13 10 77 U812 (GA) 13 13 100 U810 (GA) T 9 6 67 U857 (AC) YG 12 10 83 U841 (GA) YC

7、 13 12 92 U834 (AG) TG 12 10 83 U813 (CT) T 8 6 75 U842 (GA) YG 10 8 80 U855 (AC) YT 18 17 94 總數(shù)Sum 120 102 85 平均Average 12 10.2 85 圖1引物U834擴(kuò)增金柑種質(zhì)資源的ISSR電泳圖泳道:M:DL2000marker；其它泳道編號(hào)代表的樣品名稱參見表1。Fig.1ElectrophoresispatternamplifiedfromFortunellaGermplasmResourceswithprimer834Note:M:DL2000marker;124:For

8、tunellaGermplasmResourcescodeNo.seenintable12.2親緣關(guān)系分析用Ntedit軟件計(jì)算10條ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果在每個(gè)供試資源之間的相似系數(shù)，結(jié)果顯示：在供試的25份材料中，不同資源間遺傳相似系數(shù)的范圍為0.480.99。用UPGMA法構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖圖2。在遺傳相似系數(shù)為0.85的水平上，25份資源資源可分為8組：第1組包括：融安金彈、陽朔金彈1號(hào)、陽朔金彈2號(hào)、陽朔金彈3號(hào)、融安滑皮金柑、誘變金柑1號(hào)、誘變金柑2號(hào)材料16,12,13；第2組包括：金棗及其實(shí)生后代、越南金柑6號(hào)、寧波羅紋材料9、10、20、21；第3組包括：長壽金柑及其實(shí)珠心苗材

9、料7、8；第4組：福建金豆材料22；第5組包括：金豆2002-29、金豆2002-30和金豆2002-36材料23、24、25；第6組：山桔金柑材料11。第7組：四季桔；第8組：越南金柑15號(hào)材料15、16、17、18、19。第1組中，融安滑皮金柑與陽朔金彈1遺傳相似系數(shù)最大，達(dá)0.98，與融安金彈的遺傳相似系數(shù)為0.97，證明為金彈的變異系，誘變金柑1號(hào)與融安金彈的遺傳相似系數(shù)最大，為0.95，從引物U834的擴(kuò)增結(jié)果看，誘變金柑1號(hào)與金彈比擬，多一條特異帶圖1箭頭處，說明已發(fā)生一定的變異，其遺傳特性有待進(jìn)一步研究；第二組中，越南金柑6號(hào)與金棗、寧波羅紋聚在一起，但與金棗實(shí)生苗的遺傳相似系數(shù)

10、較大，為0.90，其葉片及果實(shí)形態(tài)與金棗的相似度也很高，應(yīng)為同一起源，金棗與寧波羅紋的親緣關(guān)系比其它種之間近；越南引進(jìn)的金柑資源15號(hào)均聚在金柑和四季桔之外，與四季桔親緣關(guān)系較近，可能也是金柑與其它柑桔的雜交后代；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所提供的4份金豆資源中，福建金豆與其它3種金豆資源分開，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)小于0.78；四季桔聚在金柑屬其它種與越南金柑15號(hào)資源之間；它與金彈的遺傳相似系數(shù)比四季桔與金彈的遺傳相似系數(shù)大。圖225份供試金柑資源的ISSR聚類圖Fig2.Dendrogramofthe25FortunellaaccessionsbyISSRmakersbakesonUPG

11、MAanalysis3討論根據(jù)本研究結(jié)果，在遺傳系數(shù)為0.85處將25份資源劃分為8類，即金彈及其變異系，金棗、越南金柑6號(hào)和寧波羅紋，長壽金柑，福建金豆；金豆2002-29，2002-30，2002-36，山桔金柑，四季桔，越南金柑15號(hào)。金柑野生種質(zhì)、引進(jìn)資源及栽培種的變異系的親緣關(guān)系根本明確，原有金柑屬種間的聚類結(jié)果與前人的分類根本一致。融安滑皮金柑與陽朔金彈1遺傳相似系數(shù)最大，達(dá)0.98，與融安金彈的遺傳相似系數(shù)為0.97，證明其為金彈的變異系。越南引進(jìn)的金柑資源中，越南金柑6號(hào)與金棗、寧波羅紋聚在一起，與金棗實(shí)生苗的遺傳相似系數(shù)為0.9，其葉片及果實(shí)形態(tài)與金棗的相似度也很高，應(yīng)為同一

12、起源，其余的15號(hào)均聚在金柑和四季桔之外，與四季桔親緣關(guān)系較近，可能也是金柑與其它柑桔的雜交后代。誘變金柑1號(hào)和2號(hào)是金彈經(jīng)秋水仙素誘變多倍體的后代，誘變金柑1號(hào)與融安金彈的遺傳相似系數(shù)最大，為0.95，從引物U834的擴(kuò)增結(jié)果看，誘變金柑1號(hào)與金彈比擬，多一條特異帶圖1箭頭處，目前2個(gè)單株均已經(jīng)開花結(jié)果，形態(tài)和細(xì)胞學(xué)上有明顯的特異性，說明已發(fā)生一定的變異，其遺傳特性有待進(jìn)一步研究。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所提供的4份金豆資源中，福建金豆與其它3種金豆資源分開，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)小于0.78。四季桔聚在金柑屬其它種與越南金柑15號(hào)資源之間，說明它與金柑和柑橘屬均有親緣關(guān)系，支持了前人的分

13、類結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，它與金彈的遺傳相似系數(shù)比四季桔與金彈的遺傳相似系數(shù)大，達(dá)0.78。形態(tài)上與原有的金柑屬中所描述的山金柑和長葉金柑有些相似，但與山金柑比擬，它不是四倍體，與長葉金柑比擬，其葉片形態(tài)和果實(shí)色澤不一致，山金柑和長葉金柑均沒有單胚性狀的描述，因此認(rèn)為山桔金柑可能是金柑屬的新變種或種類。因其具有單胚性及早熟等特性，是金柑優(yōu)良的育種資源。4.結(jié)論10條引物共擴(kuò)增出120條帶，其中102條具有多態(tài)性，多態(tài)性帶比率為85%。用UPGMA軟件進(jìn)行聚類分析，25份在遺傳系數(shù)為0.85處可將25資源劃分為以下8組，第1組包括：融安金彈、陽朔金彈及金彈變異系；第2組包括：金棗、越南金柑6號(hào)及寧波羅

14、紋；第3組：長壽金柑；第4組：福建金豆；第5組包括：金豆2002-29、金豆2002-30和金豆2002-36；第6組：山桔金柑；第7組：四季桔；第8組：越南金柑15號(hào)。親緣關(guān)系分析結(jié)果說明：融安滑皮金柑為金彈的變異系；中越邊境的山桔金柑;可能為金柑屬的新變種或種類；越南引進(jìn)的金柑資源中，越南金柑6號(hào)與金棗應(yīng)為同一起源，其余的越南金柑資源疑為金柑與寬皮柑桔的雜交后代；誘變金柑1號(hào)與金彈的遺傳相似系數(shù)為0.95，形態(tài)上有明顯的變異，其遺傳特性有待進(jìn)一步研究。致謝：謹(jǐn)向在本研究的資源調(diào)查、收集及試驗(yàn)過程中給予協(xié)助的單位和同行表示衷心的感謝！由于篇幅有限，具體名單不一一列出。參考文獻(xiàn)1 CHEN Jie-zhong ,Fruit Growing of Particular Species .Beijing:China Agriculture Press,2003:42 HUANG Gui-xiang, HE Jing. F.crassifolia Swingle High