海洋科學(xué)概論課間實(shí)驗(yàn)手冊(cè)

1、“海洋科學(xué)概論”課間實(shí)驗(yàn)手冊(cè)海洋化學(xué)實(shí)驗(yàn)（張朝暉教授、袁佳俊、唐韜編寫(xiě)）海水中亞硝氮和硝氮含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：海工樓230實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)間：8月27日下午3-5pm正式實(shí)驗(yàn)時(shí)間：8月28日下午1-5pm實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)人員：袁佳俊、陳亞文、辛若雪、朱靜實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮Ｋ械脑S多元素是海洋生物生長(zhǎng)所必需的，如H、C、O、N、P、Si、Mg、Cl、K、S、Ca、Fe、Co、Cu、Zn、Se等。這些元素根據(jù)其在海水中的含量多少，可以分為主量元素、微量元素和痕量元素。在天然海水中，主量元素例如CO2, SO42-, H3BO3, Mg2+, Cl-, K+, Ca2+等含量很高，遠(yuǎn)超出海洋生物生長(zhǎng)所需要，通常不考

2、慮為營(yíng)養(yǎng)鹽。一些痕量元素，如Fe、Mn、Co、Zn、Se等由于在海水中含量很低，但是也為海洋生物所必須，一般稱為痕量營(yíng)養(yǎng)鹽。我們通常所關(guān)心的營(yíng)養(yǎng)鹽指的是N、P、Si是海洋生物生長(zhǎng)所必需的最重要元素，也是海洋初級(jí)生產(chǎn)過(guò)程和食物鏈的基礎(chǔ)。習(xí)慣上，將溶解無(wú)機(jī)氮化合物（包括硝酸鹽、亞硝酸鹽和銨鹽）、溶解磷酸鹽以及溶解硅酸鹽稱為營(yíng)養(yǎng)鹽。海水中營(yíng)養(yǎng)鹽濃度過(guò)低，會(huì)抑制浮游植物生長(zhǎng)，從而降低海洋初級(jí)生產(chǎn)力；當(dāng)海水中營(yíng)養(yǎng)鹽過(guò)高時(shí)，浮游植物可能將瘋狂生長(zhǎng)而引發(fā)赤潮，對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境造成破壞。因此營(yíng)養(yǎng)鹽的監(jiān)測(cè)尤為重要。本實(shí)驗(yàn)以無(wú)機(jī)氮化合物中的亞硝酸鹽、硝酸鹽的濃度測(cè)定為例，讓同學(xué)們初步認(rèn)識(shí)海水樣品的營(yíng)養(yǎng)鹽測(cè)定過(guò)程。并

3、結(jié)合物理海洋的介紹，討論海岸帶地區(qū)營(yíng)養(yǎng)鹽的不均一性和受控因素。實(shí)驗(yàn)原理經(jīng)典的營(yíng)養(yǎng)鹽測(cè)定方法（分光光度法）都是基于Beer-Lambert定律：在一定濃度內(nèi)，吸光度（A）與濃度呈線性關(guān)系。即，A=logI0I=cdI0為初始光強(qiáng)；I通過(guò)樣品后的光強(qiáng)；為摩爾吸光系數(shù)；c為樣品濃度；d為光程長(zhǎng)度，通常為比色池長(zhǎng)度 ADDIN NE.Ref.14B95E79-1BA2-4B77-9323-9A36066423E2(Ingle Jr & Crouch, 1988)。通過(guò)建立吸光度與已知濃度的線性關(guān)系，再測(cè)定未知樣品中的吸光度，來(lái)反推未知樣中營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度。但是由于營(yíng)養(yǎng)鹽溶解在水中呈無(wú)色（即在可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍

4、內(nèi)無(wú)吸光值），不能直接進(jìn)行吸光度的測(cè)量。因此需要進(jìn)行簡(jiǎn)單化學(xué)反應(yīng)使其顯現(xiàn)出顏色，從而在可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)可測(cè)得吸光值。海水中的亞硝酸鹽測(cè)定通常采用格里斯（Griess）反應(yīng)顯色，格里斯試劑是含有對(duì)氨基苯磺酰胺（磺胺）和N-(1-萘基)乙二胺（萘乙二胺）的酸性溶液。在酸性條件下，水樣中的亞硝酸鹽與磺胺進(jìn)行重氮化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與萘乙二胺作用形成紫紅色偶氮化合物，從而可以用Beer-Lambert定律計(jì)算樣品中的亞硝酸鹽濃度 ADDIN NE.Ref.C1CE1E0E-2452-4D53-ADD6-660F83885BEC(Hansen & Koroleff, 1999)。測(cè)量海水中的硝酸鹽，一般的流

5、程是先將其還原為亞硝酸鹽，再按照亞硝酸鹽的測(cè)定方法進(jìn)行顯色測(cè)定。傳統(tǒng)的還原方法是將海水通過(guò)鎘（Cd）粒填充的玻璃柱，利用Cd將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽 ADDIN NE.Ref.7C8361FA-710C-42FD-8B6D-848684B51CC0(Wood et al., 1967)。然而，Cd是一種廣為人知的劇毒重金屬，是造成日本“痛痛病”的元兇；Cd柱還原效率會(huì)受到Cd粒品質(zhì)的影響，高品質(zhì)的Cd粒依賴進(jìn)口，實(shí)際成本不低；Cd柱還原法操作較復(fù)雜，且一根柱子無(wú)法同時(shí)處理多個(gè)樣品。我們采用毒性低、操作簡(jiǎn)便的三氯化釩（VCl3）方法進(jìn)行硝酸鹽的還原。海水中的硝酸鹽在VCl3的存在下，于45下加熱約

6、1 h，幾乎可以被定量還原為亞硝酸鹽，然后按照Griess反應(yīng)顯色，得到水樣中（硝酸鹽+亞硝酸鹽）的濃度，減去亞硝酸鹽濃度后即可得到硝酸鹽濃度 ADDIN NE.Ref.C032DBB0-F008-4E7C-8455-B5DCAB808904(Schnetger & Lehners, 2014)。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備此次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的方法采用經(jīng)典的分光光度法，主要的儀器是分光光度計(jì)。需要使用的試劑：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與標(biāo)準(zhǔn)使用液：根據(jù)原理我們首先得制作一條吸光度與已知濃度之間的關(guān)系曲線并得到線性方程，因此需要配置出已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)行稀釋得到不同濃度的點(diǎn)。配置內(nèi)容及過(guò)程如下：（儲(chǔ)備液由實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)人員準(zhǔn)備）亞硝酸鹽

7、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10.00 mM）：稱取NaNO2（100干燥1 h） 0.690 g溶解于1000 mL去離子水中（用容量瓶配），棕色瓶冷藏保存。請(qǐng)同學(xué)們稀釋100倍后為100 M標(biāo)準(zhǔn)使用液。硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（20.00 mM）：稱取0.850 g NaNO3（100干燥1 h，在干燥器中冷卻后稱量）溶于500 mL去離子水中（用容量瓶），冷藏保存。請(qǐng)同學(xué)們稀釋200倍后為100 M標(biāo)準(zhǔn)使用液。顯色劑：使待測(cè)營(yíng)養(yǎng)鹽能與顯色劑定量反應(yīng)而顯現(xiàn)出顏色（顏色的深淺只與營(yíng)養(yǎng)鹽含量有關(guān)），并能吸收一定波長(zhǎng)下的光。測(cè)亞硝酸鹽所用顯色劑：2%磺胺溶液：稱取2 g磺胺溶于100 mL 10%鹽酸（10 mL濃鹽酸

8、+90 mL去離子水）中，轉(zhuǎn)移至試劑瓶。0.1%鹽酸萘乙二胺溶液：0.1 g鹽酸萘乙二胺溶于100 mL去離子水，冷藏保存。亞硝酸鹽顯色劑（格里斯試劑）：將上述兩種溶液按體積比1:1混合，冷藏保存。測(cè)硝酸鹽所用還原劑（實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)人員準(zhǔn)備）：三氯化釩溶液：稱取800 mg三氯化釩加入于約20 mL去離子水中，充分溶解；再加入8.4 mL濃鹽酸溶解剩余部分，加入去離子水補(bǔ)充至100 mL，冷藏保存。樣品的采集兩份海水樣品采自舟山的朱家尖和惠民橋。這兩個(gè)地方的渾濁度差別很大（請(qǐng)思考為什么）。樣品的采集工作將由研究生助教完成。海水樣品使用0.45 m濾膜過(guò)濾，取2.00 mL濾液置于帶蓋試管中，平行3份

9、。處理過(guò)的海水樣品提供給同學(xué)們用于分析。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程亞硝酸鹽測(cè)定步驟亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)系列：分別移取標(biāo)準(zhǔn)使用液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL于帶蓋試管中，加入去離子水至50.00 mL，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度。吸光度測(cè)定：在50.00 mL標(biāo)準(zhǔn)系列或樣品中，加入2 mL格里斯試劑，搖勻。15 min后，轉(zhuǎn)移至比色皿中，以去離子水為空白，進(jìn)行比色測(cè)定吸光度A。硝酸鹽測(cè)定步驟（建議先做硝酸鹽測(cè)定，在等待反應(yīng)時(shí)完成亞硝酸鹽測(cè)定）硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)系列：分別移取標(biāo)準(zhǔn)使用液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL于帶蓋試管中，加入去離子水至2.00 mL，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃

10、度。吸光度測(cè)定：在2.00 mL標(biāo)準(zhǔn)系列或樣品中，加入1.20 mL三氯化釩溶液和0.30 mL格里斯試劑，搖勻，塞住塞子。45水浴或烘箱加熱1 h，轉(zhuǎn)移至比色皿中，以去離子水為空白，進(jìn)行比色測(cè)定吸光度A。請(qǐng)將結(jié)果填入實(shí)驗(yàn)報(bào)告的對(duì)應(yīng)表格工作曲線的制定及水樣測(cè)定結(jié)果記錄使用分光光度計(jì)及處理吸光度A時(shí)的幾點(diǎn)說(shuō)明：（1）用分光光光度計(jì)測(cè)定吸光度A前，需要用去離子水進(jìn)行調(diào)零。（2）比色皿厚度的選擇需要根據(jù)顯現(xiàn)顏色深淺進(jìn)行選擇，盡可能將吸光度A控制在0.7以下，并且測(cè)量過(guò)程中比色皿不可更換；每次使用前需用待測(cè)樣品潤(rùn)洗比色皿2遍，或用去離子水洗凈后用乙醇沖洗并吹干。（3）由于顯色劑本身會(huì)對(duì)吸收較少的光，因

11、此必須將顯色劑吸光度扣除，即需要扣除濃度為0的標(biāo)樣吸光度值A(chǔ)0。請(qǐng)將結(jié)果填入實(shí)驗(yàn)報(bào)告的對(duì)應(yīng)表格。并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告， 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和海水樣品亞硝酸鹽含量的測(cè)定將濃度c為縱坐標(biāo)，(A-A0)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得：c=a+ b(A-A0), 其中a為縱軸截距，b為斜率。注：請(qǐng)注意單位的換算。表1 亞硝酸鹽工作曲線制作序號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)使用液體積（mL）亞硝氮濃度cNO2-（）吸光度AA-A0標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度： ；波長(zhǎng)： ；比色皿光程： 表2 水樣亞硝酸鹽測(cè)定和計(jì)算結(jié)果水樣編號(hào)S-1S-2S-3水樣體積（mL）吸光度AA-A0cNO2-（M）硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和海水樣品硝酸鹽含量的測(cè)定

12、表3 硝酸鹽工作曲線制作序號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)使用液體積（mL）硝氮濃度cNO3-（M）吸光度AA-A0標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度： ；波長(zhǎng)： ；比色皿光程： 表4 水樣硝酸鹽測(cè)定和計(jì)算結(jié)果水樣編號(hào)S-1S-2S-3水樣體積（mL）吸光度AA-A0cNO2-+cNO3-（M）cNO3-（M）思考和作業(yè)請(qǐng)?zhí)峤灰环輰?shí)驗(yàn)報(bào)告，包括以下幾部分（基于自己的理解，用自己的語(yǔ)言表達(dá)）： 實(shí)驗(yàn)原理：最好用幾句話概括。實(shí)驗(yàn)過(guò)程描述。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄：要求（1）參考手冊(cè)中的表格繪制數(shù)據(jù)記錄表并完成表格；（2）繪制工作曲線并進(jìn)行線性擬合得出擬合方程與R2值（用Excel繪制即可）。結(jié)論與討論：（1）對(duì)照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，你認(rèn)為該地海水屬第幾

13、類海水？（2）結(jié)合你在海洋科學(xué)概論課堂上學(xué)到的知識(shí)，討論造成朱家尖和惠民橋附近海水中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量差異的原因?qū)τ谀壳爸凵胶Ｓ蚋粻I(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重的情況，請(qǐng)?zhí)岢?2點(diǎn)你認(rèn)為可行的解決方法。 ADDIN NE.Bib參考文獻(xiàn)1、Hansen, H.P., Koroleff, F., (1999) Determination of nutrients. Methods of seawater analysis, 159-228.2、Ingle Jr, J.D., Crouch, S.R., (1988) Spectrochemical analysis.3、Schnetger, B., Lehners, C., (2014) Determination of nitrate plus nitrite in small volume marine water samples using vanadium(III)chloride as a reduction agent. Marine Chemistry, 160, 91-98