海洋科學(xué)概論課間實驗手冊

1、“海洋科學(xué)概論”課間實驗手冊海洋化學(xué)實驗（張朝暉教授、袁佳俊、唐韜編寫）海水中亞硝氮和硝氮含量的測定實驗地點：海工樓230實驗室實驗準(zhǔn)備時間：8月27日下午3-5pm正式實驗時間：8月28日下午1-5pm實驗指導(dǎo)人員：袁佳俊、陳亞文、辛若雪、朱靜實驗?zāi)康暮Ｋ械脑S多元素是海洋生物生長所必需的，如H、C、O、N、P、Si、Mg、Cl、K、S、Ca、Fe、Co、Cu、Zn、Se等。這些元素根據(jù)其在海水中的含量多少，可以分為主量元素、微量元素和痕量元素。在天然海水中，主量元素例如CO2, SO42-, H3BO3, Mg2+, Cl-, K+, Ca2+等含量很高，遠(yuǎn)超出海洋生物生長所需要，通常不考

2、慮為營養(yǎng)鹽。一些痕量元素，如Fe、Mn、Co、Zn、Se等由于在海水中含量很低，但是也為海洋生物所必須，一般稱為痕量營養(yǎng)鹽。我們通常所關(guān)心的營養(yǎng)鹽指的是N、P、Si是海洋生物生長所必需的最重要元素，也是海洋初級生產(chǎn)過程和食物鏈的基礎(chǔ)。習(xí)慣上，將溶解無機(jī)氮化合物（包括硝酸鹽、亞硝酸鹽和銨鹽）、溶解磷酸鹽以及溶解硅酸鹽稱為營養(yǎng)鹽。海水中營養(yǎng)鹽濃度過低，會抑制浮游植物生長，從而降低海洋初級生產(chǎn)力；當(dāng)海水中營養(yǎng)鹽過高時，浮游植物可能將瘋狂生長而引發(fā)赤潮，對海洋生態(tài)環(huán)境造成破壞。因此營養(yǎng)鹽的監(jiān)測尤為重要。本實驗以無機(jī)氮化合物中的亞硝酸鹽、硝酸鹽的濃度測定為例，讓同學(xué)們初步認(rèn)識海水樣品的營養(yǎng)鹽測定過程。并

3、結(jié)合物理海洋的介紹，討論海岸帶地區(qū)營養(yǎng)鹽的不均一性和受控因素。實驗原理經(jīng)典的營養(yǎng)鹽測定方法（分光光度法）都是基于Beer-Lambert定律：在一定濃度內(nèi)，吸光度（A）與濃度呈線性關(guān)系。即，A=logI0I=cdI0為初始光強(qiáng)；I通過樣品后的光強(qiáng)；為摩爾吸光系數(shù)；c為樣品濃度；d為光程長度，通常為比色池長度 ADDIN NE.Ref.14B95E79-1BA2-4B77-9323-9A36066423E2(Ingle Jr & Crouch, 1988)。通過建立吸光度與已知濃度的線性關(guān)系，再測定未知樣品中的吸光度，來反推未知樣中營養(yǎng)鹽的濃度。但是由于營養(yǎng)鹽溶解在水中呈無色（即在可見光波長范圍

4、內(nèi)無吸光值），不能直接進(jìn)行吸光度的測量。因此需要進(jìn)行簡單化學(xué)反應(yīng)使其顯現(xiàn)出顏色，從而在可見光波長范圍內(nèi)可測得吸光值。海水中的亞硝酸鹽測定通常采用格里斯（Griess）反應(yīng)顯色，格里斯試劑是含有對氨基苯磺酰胺（磺胺）和N-(1-萘基)乙二胺（萘乙二胺）的酸性溶液。在酸性條件下，水樣中的亞硝酸鹽與磺胺進(jìn)行重氮化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與萘乙二胺作用形成紫紅色偶氮化合物，從而可以用Beer-Lambert定律計算樣品中的亞硝酸鹽濃度 ADDIN NE.Ref.C1CE1E0E-2452-4D53-ADD6-660F83885BEC(Hansen & Koroleff, 1999)。測量海水中的硝酸鹽，一般的流

5、程是先將其還原為亞硝酸鹽，再按照亞硝酸鹽的測定方法進(jìn)行顯色測定。傳統(tǒng)的還原方法是將海水通過鎘（Cd）粒填充的玻璃柱，利用Cd將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽 ADDIN NE.Ref.7C8361FA-710C-42FD-8B6D-848684B51CC0(Wood et al., 1967)。然而，Cd是一種廣為人知的劇毒重金屬，是造成日本“痛痛病”的元兇；Cd柱還原效率會受到Cd粒品質(zhì)的影響，高品質(zhì)的Cd粒依賴進(jìn)口，實際成本不低；Cd柱還原法操作較復(fù)雜，且一根柱子無法同時處理多個樣品。我們采用毒性低、操作簡便的三氯化釩（VCl3）方法進(jìn)行硝酸鹽的還原。海水中的硝酸鹽在VCl3的存在下，于45下加熱約

6、1 h，幾乎可以被定量還原為亞硝酸鹽，然后按照Griess反應(yīng)顯色，得到水樣中（硝酸鹽+亞硝酸鹽）的濃度，減去亞硝酸鹽濃度后即可得到硝酸鹽濃度 ADDIN NE.Ref.C032DBB0-F008-4E7C-8455-B5DCAB808904(Schnetger & Lehners, 2014)。實驗準(zhǔn)備此次實驗測定的方法采用經(jīng)典的分光光度法，主要的儀器是分光光度計。需要使用的試劑：標(biāo)準(zhǔn)儲備液與標(biāo)準(zhǔn)使用液：根據(jù)原理我們首先得制作一條吸光度與已知濃度之間的關(guān)系曲線并得到線性方程，因此需要配置出已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)行稀釋得到不同濃度的點。配置內(nèi)容及過程如下：（儲備液由實驗指導(dǎo)人員準(zhǔn)備）亞硝酸鹽

7、標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10.00 mM）：稱取NaNO2（100干燥1 h） 0.690 g溶解于1000 mL去離子水中（用容量瓶配），棕色瓶冷藏保存。請同學(xué)們稀釋100倍后為100 M標(biāo)準(zhǔn)使用液。硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液（20.00 mM）：稱取0.850 g NaNO3（100干燥1 h，在干燥器中冷卻后稱量）溶于500 mL去離子水中（用容量瓶），冷藏保存。請同學(xué)們稀釋200倍后為100 M標(biāo)準(zhǔn)使用液。顯色劑：使待測營養(yǎng)鹽能與顯色劑定量反應(yīng)而顯現(xiàn)出顏色（顏色的深淺只與營養(yǎng)鹽含量有關(guān)），并能吸收一定波長下的光。測亞硝酸鹽所用顯色劑：2%磺胺溶液：稱取2 g磺胺溶于100 mL 10%鹽酸（10 mL濃鹽酸

8、+90 mL去離子水）中，轉(zhuǎn)移至試劑瓶。0.1%鹽酸萘乙二胺溶液：0.1 g鹽酸萘乙二胺溶于100 mL去離子水，冷藏保存。亞硝酸鹽顯色劑（格里斯試劑）：將上述兩種溶液按體積比1:1混合，冷藏保存。測硝酸鹽所用還原劑（實驗指導(dǎo)人員準(zhǔn)備）：三氯化釩溶液：稱取800 mg三氯化釩加入于約20 mL去離子水中，充分溶解；再加入8.4 mL濃鹽酸溶解剩余部分，加入去離子水補(bǔ)充至100 mL，冷藏保存。樣品的采集兩份海水樣品采自舟山的朱家尖和惠民橋。這兩個地方的渾濁度差別很大（請思考為什么）。樣品的采集工作將由研究生助教完成。海水樣品使用0.45 m濾膜過濾，取2.00 mL濾液置于帶蓋試管中，平行3份

9、。處理過的海水樣品提供給同學(xué)們用于分析。實驗操作過程亞硝酸鹽測定步驟亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)系列：分別移取標(biāo)準(zhǔn)使用液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL于帶蓋試管中，加入去離子水至50.00 mL，計算標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度。吸光度測定：在50.00 mL標(biāo)準(zhǔn)系列或樣品中，加入2 mL格里斯試劑，搖勻。15 min后，轉(zhuǎn)移至比色皿中，以去離子水為空白，進(jìn)行比色測定吸光度A。硝酸鹽測定步驟（建議先做硝酸鹽測定，在等待反應(yīng)時完成亞硝酸鹽測定）硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)系列：分別移取標(biāo)準(zhǔn)使用液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL于帶蓋試管中，加入去離子水至2.00 mL，計算標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃

10、度。吸光度測定：在2.00 mL標(biāo)準(zhǔn)系列或樣品中，加入1.20 mL三氯化釩溶液和0.30 mL格里斯試劑，搖勻，塞住塞子。45水浴或烘箱加熱1 h，轉(zhuǎn)移至比色皿中，以去離子水為空白，進(jìn)行比色測定吸光度A。請將結(jié)果填入實驗報告的對應(yīng)表格工作曲線的制定及水樣測定結(jié)果記錄使用分光光度計及處理吸光度A時的幾點說明：（1）用分光光光度計測定吸光度A前，需要用去離子水進(jìn)行調(diào)零。（2）比色皿厚度的選擇需要根據(jù)顯現(xiàn)顏色深淺進(jìn)行選擇，盡可能將吸光度A控制在0.7以下，并且測量過程中比色皿不可更換；每次使用前需用待測樣品潤洗比色皿2遍，或用去離子水洗凈后用乙醇沖洗并吹干。（3）由于顯色劑本身會對吸收較少的光，因

11、此必須將顯色劑吸光度扣除，即需要扣除濃度為0的標(biāo)樣吸光度值A(chǔ)0。請將結(jié)果填入實驗報告的對應(yīng)表格。并完成實驗報告， 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和海水樣品亞硝酸鹽含量的測定將濃度c為縱坐標(biāo)，(A-A0)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得：c=a+ b(A-A0), 其中a為縱軸截距，b為斜率。注：請注意單位的換算。表1 亞硝酸鹽工作曲線制作序號012345標(biāo)準(zhǔn)使用液體積（mL）亞硝氮濃度cNO2-（）吸光度AA-A0標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度： ；波長： ；比色皿光程： 表2 水樣亞硝酸鹽測定和計算結(jié)果水樣編號S-1S-2S-3水樣體積（mL）吸光度AA-A0cNO2-（M）硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和海水樣品硝酸鹽含量的測定

12、表3 硝酸鹽工作曲線制作序號012345標(biāo)準(zhǔn)使用液體積（mL）硝氮濃度cNO3-（M）吸光度AA-A0標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度： ；波長： ；比色皿光程： 表4 水樣硝酸鹽測定和計算結(jié)果水樣編號S-1S-2S-3水樣體積（mL）吸光度AA-A0cNO2-+cNO3-（M）cNO3-（M）思考和作業(yè)請?zhí)峤灰环輰嶒瀳蟾?，包括以下幾部分（基于自己的理解，用自己的語言表達(dá)）： 實驗原理：最好用幾句話概括。實驗過程描述。實驗數(shù)據(jù)記錄：要求（1）參考手冊中的表格繪制數(shù)據(jù)記錄表并完成表格；（2）繪制工作曲線并進(jìn)行線性擬合得出擬合方程與R2值（用Excel繪制即可）。結(jié)論與討論：（1）對照國家標(biāo)準(zhǔn)，你認(rèn)為該地海水屬第幾

13、類海水？（2）結(jié)合你在海洋科學(xué)概論課堂上學(xué)到的知識，討論造成朱家尖和惠民橋附近海水中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量差異的原因?qū)τ谀壳爸凵胶Ｓ蚋粻I養(yǎng)化嚴(yán)重的情況，請?zhí)岢?2點你認(rèn)為可行的解決方法。 ADDIN NE.Bib參考文獻(xiàn)1、Hansen, H.P., Koroleff, F., (1999) Determination of nutrients. Methods of seawater analysis, 159-228.2、Ingle Jr, J.D., Crouch, S.R., (1988) Spectrochemical analysis.3、Schnetger, B., Lehners, C., (2014) Determination of nitrate plus nitrite in small volume marine water samples using vanadium(III)chloride as a reduction agent. Marine Chemistry, 160, 91-98