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文檔簡(jiǎn)介
1、.:.;痰液細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的規(guī)范化操作程序盧先雷前言 眾所周知,傳統(tǒng)習(xí)慣程序的痰標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)其臨床符合率并不高,其緣由是多方面的。除了痰標(biāo)本采集不規(guī)范導(dǎo)致的不合格標(biāo)本帶來(lái)的培育結(jié)果與病人感染不相符外,還由于微生物和人體的相關(guān)性本身就具有復(fù)雜性:源自細(xì)菌的致病與條件致病的辨證性,如致病菌能夠?yàn)檎y帶,而細(xì)菌在肺通氣功能異常病人的下呼吸道的可以發(fā)生單純定植或感染,要證明培育結(jié)果與感染的相關(guān)性是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)所面臨的難題,這也使得不斷以來(lái)在對(duì)于痰培育的規(guī)范化進(jìn)展非常緩慢,以致在各版上也未提出相應(yīng)詳細(xì)可行的令全國(guó)同行公認(rèn)的一致規(guī)范的規(guī)范化操作程序SOP和完好的痰液培育的質(zhì)量控制方法。習(xí)慣程序的痰標(biāo)本細(xì)菌
2、學(xué)檢驗(yàn)的緩慢也很不順應(yīng)臨床診斷治療的迫切性。故而,建立規(guī)范而快速的痰液細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的SOP對(duì)于提高呼吸系統(tǒng)感染病的診治程度和控制抗生素的濫用等問(wèn)題均有重要的作用痰培育陽(yáng)性率普遍教低,臨床符合率差的關(guān)鍵要素是痰標(biāo)本采集不規(guī)范,不合格痰標(biāo)本將直接導(dǎo)致病原菌被分別的時(shí)機(jī)降低,大量正常菌群也會(huì)抑制病原菌的生長(zhǎng)或干擾病原菌的檢出,降低了臨床符合率;再有就是操作程序的不規(guī)范,不注重直接涂片,檢驗(yàn)過(guò)程控制的不嚴(yán)密也是導(dǎo)致臨床符合率低的重要緣由。他們經(jīng)過(guò)SOP的臨床運(yùn)用情況的分析,痰培育陽(yáng)性率和臨床符合率均能夠被提高,并且細(xì)菌分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示本文與國(guó)外文獻(xiàn)所報(bào)道的情況根本一致。對(duì)于直接涂片的意義,在于判別標(biāo)本中
3、微生物有無(wú)、類(lèi)型、染色特性、形狀特征,標(biāo)本的污染情況,還可對(duì)痰標(biāo)本中能夠的病原菌初步診斷(根據(jù)人體被病原菌感染后的炎性滲出包裹和白細(xì)胞吞噬反響),判別能否存在復(fù)數(shù)菌感染,動(dòng)態(tài)察看處于治療過(guò)程中不同時(shí)期所送檢的標(biāo)本中病原菌情況的變化好像種病原菌數(shù)量的增減,機(jī)體的免疫反響,菌群的交替。甚至可以推斷臨床治療療效和病人病情的變化和轉(zhuǎn)歸,醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生等,具有重要意義。為了滿(mǎn)足高質(zhì)量需求,對(duì)首代分別培育基應(yīng)該進(jìn)展嚴(yán)厲的質(zhì)量控制。另外,對(duì)首代分別培育基的選用和搭配的合理化也需求進(jìn)展討論。為了縮短鑒定時(shí)間,在細(xì)菌鑒定中可采用酶法鑒定:所謂酶法鑒定:國(guó)外八十年代中一些微生物學(xué)家在研討中發(fā)現(xiàn)由于細(xì)菌在生長(zhǎng)分裂
4、過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)集聚了大量的與物質(zhì)代謝相關(guān)的各種酶類(lèi),可在短時(shí)間內(nèi)釋放到胞外稱(chēng)胞外酶可迅速分解相應(yīng)底物。故而,當(dāng)在高靈敏微量生化反響培育基中參與大量濃重的菌液時(shí),那么無(wú)須細(xì)菌繁衍就能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生反響。根據(jù)這一實(shí)際采用高靈敏微量生化反響單元與數(shù)值分類(lèi)法相結(jié)合而成的酶法生化編碼鑒定系統(tǒng)可對(duì)細(xì)菌進(jìn)展快速鑒定如API rapid E/NH n、Sensititre AP、MicroScan Rapid Neg ID、Vitek GNI+、RapID onE、超聲波輔助快速酶法革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng),鑒定時(shí)間可縮短至小時(shí)。但鏈球菌由于首代分別生長(zhǎng)慢,菌落細(xì)小,不能搜集充足菌量,暫不能采用酶法鑒定,其鑒定仍沿
5、用常規(guī)生化反響鑒定或免疫學(xué)方法鑒定. 規(guī)范化操作程序.標(biāo)本接納挑選方案:目測(cè):黃色、灰色、血性、鐵銹色,渾濁、 稠厚,呈現(xiàn)團(tuán)塊狀的標(biāo)本為合格標(biāo)本;而無(wú)色透明、有灰白片狀物或黑色小點(diǎn),有明顯食物渣滓、紙屑灰塵的為不合格標(biāo)本。顯微鏡下挑選:對(duì)經(jīng)過(guò)目測(cè)挑選的標(biāo)本,在洗滌前還須再經(jīng)過(guò)顯微鏡下挑選:取約 .ml痰液黃豆大小用接種環(huán)均勻涂布成cm大小的涂膜,在顯微鏡下,凡膿細(xì)胞/LP且鱗狀上皮/LP的標(biāo)本為合格標(biāo)本,可進(jìn)入下一步程序;而膿細(xì)胞+或鱗狀上皮/LP的標(biāo)本為不合格標(biāo)本,應(yīng)拒收。. 標(biāo)本預(yù)處置:按第版相關(guān)章節(jié),采用先用ml生理鹽水洗滌兩次,經(jīng)過(guò)ml生理鹽水稀釋后,參與%的PH.的胰蛋白酶溶液消化m
6、in后接種。并同時(shí)在洗滌后制造原始痰涂片,進(jìn)展染色鏡檢。. 讀片:根據(jù)人體對(duì)細(xì)菌/真菌感染在早期主要以非特異性免疫的細(xì)胞免疫為主的特點(diǎn),結(jié)合呼吸系統(tǒng)生理病理特點(diǎn),論述痰液構(gòu)成過(guò)程和排出過(guò)程,他們可以得知,在下呼吸道中感染中構(gòu)成的炎性滲出、包裹物中存在與感染直接相關(guān)的病原菌,在自然排痰的過(guò)程中會(huì)被上呼吸道的正常菌群所污染,但污染菌位于炎性包裹物之外,且人體對(duì)正常菌群具有共生性維護(hù)因此不會(huì)產(chǎn)生吞噬景象,借此實(shí)際,他們將選擇痰標(biāo)本中膿細(xì)胞成團(tuán)塊狀分布,集中而不稠密,且周?chē)鸁o(wú)鱗狀上皮細(xì)胞或無(wú)大量成團(tuán)狀分布的細(xì)菌球的區(qū)域?yàn)樽x片區(qū),仔細(xì)收尋個(gè)視野中膿細(xì)胞聚集處的膿細(xì)胞胞漿中有無(wú)吞噬的細(xì)菌及細(xì)菌的染色陳列特
7、征,菌體特征如粗細(xì)、長(zhǎng)短、扭曲并作記錄,將此作為確定病原菌的實(shí)際根據(jù)。.標(biāo)本的接種培育:普通情況接種BA、Choc含萬(wàn)古霉素mg/L、麥康凱/MecK(即“分科瓊脂NBIIA)、CHROMagar,BA、Choc置%CO、潮濕環(huán)境培育,麥康凱/MecK、CHROMagar置普通環(huán)境培育;疑心為軍團(tuán)菌的加種BCYE-培育基,疑心為百日咳的加種Boudet-Gengou培育基,疑心為肺結(jié)核的加種羅-瓊氏培育基或采用商品化專(zhuān)門(mén)的分枝桿菌培育基培育;疑心為肺炎支原體感染的加種Hayflick雙相培育基或采用免疫學(xué)及分子生物學(xué)方法檢測(cè),肺炎衣原體須用免疫學(xué)或分子生物學(xué)方法。.讀碟:經(jīng)過(guò)h隔夜培育,但孿生
8、球菌、營(yíng)養(yǎng)缺陷鏈球菌以及分枝桿菌那么需延伸培育時(shí)間. G+菌:BA生長(zhǎng)、Choc不生長(zhǎng)、MecK不生長(zhǎng),Gram染色:分G+co革蘭陽(yáng)性球菌 ,G+ b革蘭陽(yáng)性桿菌. G+co依托溶血特征,菌落形狀、菌落顏色、菌體形狀區(qū)分:葡萄球菌:淡黃色/白色,中等大小,較凸,規(guī)那么圓形,/溶血,較潮濕,除金黃色葡萄球菌外,普通不具有臨床意義;微球菌:黃色/白色/橙色,中等大小,較凸,規(guī)那么圓形,不溶血,較枯燥,不易乳化較葡萄球菌生長(zhǎng)緩慢,該菌普通無(wú)臨床意義;鏈球菌:白色/灰白色、凸起小菌落,溶血為溶血型鏈球菌;灰白隆起中心扁平或凹陷,.-.mm大小的寬大溶血為肺炎鏈球菌,該菌是最常見(jiàn)的肺部感染病原菌,在社
9、區(qū)獲得性感染中有重要的位置;細(xì)如針尖,白色凸起溶血的為草綠色鏈球菌,自然咯痰標(biāo)本中的草綠色鏈球菌普通不具有臨床意義;腸球菌:灰白,低凸,.mm左右之溶血菌落,較潮濕,但普通不具有臨床意義;口腔球菌:白色凸起較大菌落,不溶血,黏著,接種針挑之那么整個(gè)菌落挑起,瓊脂上不留痕跡。該菌偶爾可引起肺部的嚴(yán)重感染,普通好發(fā)生于COPD病人和肺氣腫病人;孿生球菌:白色、凸起細(xì)小菌落,溶血,生長(zhǎng)慢h僅.mm,在含羊血的MH瓊脂上不生長(zhǎng)。該菌是上呼吸道的正常菌群組成之一,普通不導(dǎo)致肺部感染;. G+ b依托溶血特征,菌落形狀、菌落大小、菌體形狀區(qū)分:棒狀桿菌:白色.-.mm左右大小,較枯燥,不溶血/狹窄溶血的為
10、白喉或普通棒狀桿菌;小而潮濕,灰白/無(wú)色,半透明的為J-K棒狀桿菌;灰白細(xì)小,溶血的能夠?yàn)榧俳Y(jié)核、化膿放線菌、溶血分泌桿菌;除白喉?xiàng)U菌外,假結(jié)核、化膿放線菌、溶血分泌桿菌是稀有的咽喉部病源菌,棒狀桿菌普通不導(dǎo)致肺部感染;乳桿菌:細(xì)小,白色凸起溶血菌落,有特殊的酸臭味,口腔正常菌群,無(wú)臨床意義;芽孢桿菌:灰白大菌落,外表粗糙如毛玻璃狀、蠟狀、邊緣不規(guī)那么,不同種類(lèi)菌落形狀差別宏大,寬大溶血。延伸培育時(shí)間,菌落從潮濕變得枯燥,邊緣呈放射狀分散,構(gòu)成葉狀、掌狀、雪花狀、齒輪狀等,經(jīng)常為痰培育的污染菌;BA生長(zhǎng)、Choc生長(zhǎng)、MecK不生長(zhǎng),Gram染色:G+co平面球菌、藻球菌:血瓊脂上為溶血,.-
11、.mm大小,在Choc上呈現(xiàn)金屬色澤,無(wú)臨床意義。 . G-菌:根據(jù)形狀分為G- b革蘭陰性桿菌 、G-co革蘭陰性球菌 、以及根據(jù)對(duì)特殊營(yíng)養(yǎng)的需求對(duì)苛養(yǎng)性G- b進(jìn)一步分類(lèi),常見(jiàn)的如嗜血桿菌,軍團(tuán)菌等:. BA生長(zhǎng)、Choc生長(zhǎng)、MecK生長(zhǎng),Gram染色:G- b氧化酶、分科瓊脂顏色腸桿菌:氧化酶-,分科瓊脂上黃色潮濕大菌落;弧菌:氧化酶+,分科瓊脂上淡黃色扁平大菌落;非發(fā)酵菌:氧化酶+/-,分科瓊脂上藍(lán)色/無(wú)色透明小菌落鮑曼不動(dòng)桿菌為中等大小,菌落聚集處產(chǎn)不分散黃色色素,分別菌落為蘭色;. BA生長(zhǎng)、Choc生長(zhǎng)、MecK不生長(zhǎng),Gram染色:G-co氧化酶+、觸酶+奈瑟菌:白色/黃色中
12、等大小菌落,該類(lèi)細(xì)菌為口腔常見(jiàn)正常菌群,該菌在痰培育中含量的高低反響了標(biāo)本采集形狀的合格程度,大量出現(xiàn)提示培育結(jié)果將是不可信的; 卡他莫拉菌:白色小菌落h內(nèi),菌落有脆性,用接種環(huán)推之可移,是兒科和老年病人常見(jiàn)的下呼吸道病原菌;. BA不生長(zhǎng)/細(xì)小、Choc生長(zhǎng)、MecK不生長(zhǎng),Gram染色:G-b、菌體細(xì)小或呈扭曲之長(zhǎng)絲狀嗜血桿菌:灰色/無(wú)色,半透明,.-.mm的多為流感嗜血桿菌,該菌為最常見(jiàn)的肺部感染病原菌,可發(fā)生于各個(gè)年齡層次,其高攜帶與COPD發(fā)病有較強(qiáng)的相關(guān)性;灰色略黃,不透明,.-.mm的多為副流感嗜血桿菌。普通副流感嗜血桿菌不導(dǎo)致肺部感染,大量出現(xiàn)提示培育結(jié)果將是不可信的;. BA
13、不生長(zhǎng)、Choc不生長(zhǎng)、MecK不生長(zhǎng)、BCYE-生長(zhǎng)/或在含有L-半胱氨酸、鐵離子、復(fù)合抗生素選擇劑的強(qiáng)化血瓊脂上生長(zhǎng)Gram染色:G-b、菌體細(xì)、長(zhǎng)絲狀提示能夠?yàn)檐妶F(tuán)菌:該菌在BCYE-上 h為中等大小扁平菌落,灰白色,較粘著;該菌具有較強(qiáng)的生物危險(xiǎn)性,其中嗜肺軍團(tuán)菌可傳染;.真菌及奴卡菌:BA、Choc、分科瓊脂、CHROMagar均生長(zhǎng)Gram染色形狀、生長(zhǎng)速度真菌:酵母樣真菌,菌落中等大小,生長(zhǎng)快,多數(shù)可在CHROMagar上顯色;大多為口腔咽喉正常菌群,普通不導(dǎo)致肺部感染,但免疫缺陷、糖皮質(zhì)激素、長(zhǎng)期大劑量的抗生素運(yùn)用可添加該類(lèi)微生物時(shí)機(jī)感染的能夠性;煙曲霉菌,絲狀真菌菌落,培育h
14、時(shí)菌落為白色泛綠,h后菌落迅速轉(zhuǎn)為褐色,中心粉末狀反面為黃褐色如煙熏狀,該菌為肺部最常見(jiàn)的條件致病菌,感染時(shí)患者病癥重,預(yù)后非常差;奴卡菌:小菌落,生長(zhǎng)慢,菌落皺褶,呈顆粒狀,有時(shí)產(chǎn)生褐色、黃色、黑色等色素,該類(lèi)細(xì)菌可導(dǎo)致肺膿腫,標(biāo)本膿性,有硫磺顆粒者應(yīng)高度疑心該菌;.肺炎支原體:固體培育基上,低倍鏡或解剖顯微鏡下為典型“荷包蛋樣菌落,在Hayflick雙相培育基的液體中使培育基變黃,該類(lèi)微生物是最常見(jiàn)的非典型性肺炎的病原體,在社區(qū)獲得性感染中有著很高的比例。. 細(xì)菌鑒定:在痰標(biāo)本的直接涂片鏡檢結(jié)果的指點(diǎn)下進(jìn)展分別鑒定:根據(jù)痰液涂片直接鏡檢結(jié)果中被炎性包裹及膿細(xì)胞吞噬的細(xì)菌的革蘭染色后的形狀特
15、征為指引,閱讀平皿中菌落形狀并作菌落細(xì)菌的革蘭染色,選擇與鏡檢結(jié)果一致的細(xì)菌該步驟應(yīng)該在閱歷豐富的高資歷微生物檢驗(yàn)教師的帶著下進(jìn)展,必要時(shí)進(jìn)展純培育,再根據(jù)該細(xì)菌在各種不同培育基上的生長(zhǎng)情況及相應(yīng)菌落特征進(jìn)展初步鑒定和分群,隨后在細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢特點(diǎn)、觸酶、氧化酶等簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步鑒定和分群到相關(guān)的科或?qū)俸蟛捎孟鄳?yīng)的編碼鑒定系統(tǒng)鑒定手工或自動(dòng)化鑒定,對(duì)溶血性鏈球菌及肺炎鏈球菌在生化反響的同時(shí)采用乳膠試劑作為補(bǔ)充。為了縮短鑒定時(shí)間還可采器具有培育鑒定一體化作用的多功能培育基、配合快速酶法編碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)展鑒定。. 藥敏實(shí)驗(yàn):按CLSI相關(guān)規(guī)定進(jìn)展藥敏實(shí)驗(yàn)。尚可采用特殊的藥敏實(shí)驗(yàn)察看計(jì)算方法如自動(dòng)
16、化儀器采用的光電濁度速率法、熒光速率法等縮短藥敏時(shí)間。也可按文獻(xiàn)提供的方法,及時(shí)向臨床提供一份快速的初步報(bào)告。. 結(jié)果報(bào)告:常規(guī)痰培育報(bào)告應(yīng)包括完好的病人信息、臨床診斷、抗生素運(yùn)用情況由臨床醫(yī)生在懇求單上注明、未染色標(biāo)本直接涂片結(jié)果有無(wú)膿細(xì)胞、膿細(xì)胞數(shù)量、上皮細(xì)胞數(shù)量、二者比例、有無(wú)真菌孢子菌絲、有無(wú)寄生蟲(chóng)等、Gram染色鏡檢結(jié)果包括膿細(xì)胞數(shù)量、上皮細(xì)胞與胞外正常菌群數(shù)量與污染程度、膿細(xì)胞胞內(nèi)吞噬細(xì)菌真菌孢子的情況,炎性包裹物內(nèi)細(xì)菌和真菌的存在情況、膿細(xì)胞和炎性包裹物內(nèi)的細(xì)菌真菌的染色特征、形狀特征和陳列特征、所分別細(xì)菌的鑒定結(jié)果、耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果、普通藥敏結(jié)果、該檢驗(yàn)結(jié)果與臨床診斷和治療相關(guān)性的
17、評(píng)述和建議。. 質(zhì)量控制:為保證細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的快速準(zhǔn)確和臨床符合率,應(yīng)對(duì)全過(guò)程進(jìn)展嚴(yán)厲的質(zhì)量控制。痰標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量控制包括二大部分:. 標(biāo)本的質(zhì)量控制:主要包括向臨床醫(yī)護(hù)人員講授痰標(biāo)本的正確性的采集方法、送檢時(shí)限和本卷須知,不定時(shí)的到臨床調(diào)查規(guī)范化采集的執(zhí)行情況,定期反響統(tǒng)計(jì)信息;堅(jiān)持對(duì)所送標(biāo)本進(jìn)展外觀和鏡下的初篩;堅(jiān)持標(biāo)本的直接涂片鏡檢包括不染色標(biāo)本的高倍/低倍鏡濕片鏡檢、%KOH透明后鏡檢、革蘭染色后的油鏡鏡檢。. 檢驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制,這部分又包括了以下方面和步驟:. 培育基質(zhì)量控制:主要是各種首代分別培育基的效果控制:包括不同培育基配制過(guò)程的規(guī)范化、質(zhì)控菌株生長(zhǎng)情況控制應(yīng)包括GI指
18、數(shù)測(cè)定、菌落特征典型程度、而選擇性培育基還應(yīng)監(jiān)控抑菌選擇效果、菌落顯色培育基還應(yīng)察看菌落顯色能否靈敏和鮮明,以及培育基從臨床標(biāo)本中分別出目的菌才干的測(cè)定。. 鑒定程度質(zhì)量控制:主要是采用典型質(zhì)控菌株對(duì)生化反響培育基、鑒定卡和微量生化管等試劑進(jìn)展定期測(cè)試:測(cè)試工程:典型陰陽(yáng)性反響、靈敏度、鑒定符合率和反復(fù)性。另外還應(yīng)對(duì)技術(shù)人員的技術(shù)程度的進(jìn)展不延續(xù)的再培訓(xùn)和不定期測(cè)試。. 藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制:包括對(duì)MH培育基、藥敏紙片或MIC卡的質(zhì)量控制,方法參照CLSI相關(guān)規(guī)定。對(duì)于MRS、ESBL、HLAR、AMPC、金屬-內(nèi)酰胺酶等特殊耐藥表型應(yīng)堅(jiān)持在小時(shí)察看后繼續(xù)培育至小時(shí)或小時(shí)MRS后復(fù)查一次。另外,在
19、藥敏實(shí)驗(yàn)的同時(shí)還運(yùn)用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液作劃線接種,可對(duì)所配菌液進(jìn)展純培育的驗(yàn)證,并可同時(shí)監(jiān)控菌液濃度。. 采用全程質(zhì)控觀念對(duì)標(biāo)本進(jìn)展控制:采用標(biāo)本直接涂片鏡檢結(jié)果推斷病原菌,指點(diǎn)分別鑒定方向;采用細(xì)菌培育特征營(yíng)養(yǎng)要求高低、不同選擇選擇性培育基生長(zhǎng)情況及菌落特征指點(diǎn)鑒定及對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)展核對(duì);采用鑒定結(jié)果對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)展控制或采用藥敏的特殊譜型對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)展控制即利用知菌對(duì)某種藥物的天然耐藥或天然敏感特征-;采用對(duì)臨床病歷的抽樣調(diào)查察看臨床治療效果,借以反響檢驗(yàn)結(jié)果與臨床的符合率。 參考文獻(xiàn). 過(guò)祥豹. 微生物學(xué)快速診斷法. 徐秀華主編. 臨床醫(yī)院感染.長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù),.-. . Karen C
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