PCR測定中常見問題分析

1、PCR測定中常見問題分析 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 王露楠結(jié)果不準(zhǔn)確 問題出在哪？標(biāo)本的采集與儲(chǔ)存樣本的制備-核酸純化試劑準(zhǔn)備、加樣逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、檢測結(jié)果分析報(bào)告解釋標(biāo)本的采集與儲(chǔ)存1. 采集的容器2. 儲(chǔ)存條件-HBV DNA 2-8C 室溫（25 C ） 標(biāo)本的采集與儲(chǔ)存2.儲(chǔ)存條件-HIV RNA 2-8C 室溫（25 C ）標(biāo)本的采集與儲(chǔ)存3. 檢測前及檢測后樣本的儲(chǔ)存-血清樣本 HBV DNA 檢測前 1周內(nèi)檢測 2-8C 1周以后檢測 -20C 檢測后 -20CHCV RNA 檢測前 24hr內(nèi)檢測 2-8C 24hr后檢測 -20C 檢測后 -20C/ -70C樣本的制備-核酸純化 核

2、酸提取方法 人員操作 儀器設(shè)備狀態(tài) 樣本量 樣本的制備-核酸純化一般原理：均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。一般步驟：去垢劑裂解-蛋白酶處理-有機(jī)溶劑提取-乙醇沉淀等步驟。純化目的：核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。 1. 核酸提取方法樣本的制備-核酸純化純化質(zhì)量評價(jià)：抑制物的去除 來自樣本-血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。 來自提取過程-乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽

3、酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑 。保證措施：對臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施；核酸提取及擴(kuò)增有效性的質(zhì)控樣本的制備-核酸純化2. 人員操作 加樣的準(zhǔn)確 避免交叉污染 振蕩的幅度、時(shí)間 溫育的溫度、時(shí)間 樣本的制備-核酸純化3. 儀器設(shè)備狀態(tài) 離心機(jī) 金屬浴/水浴 加樣器 全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)樣本的制備-核酸純化4.樣本量50l 樣本 靈敏度500IU/ml 200l 樣本 靈敏度50IU/ml?試劑準(zhǔn)備、加樣試劑配制的均一性、分裝的均一性常用試劑的分裝、儲(chǔ)存及使用容器加樣準(zhǔn)確性和重復(fù)性 加樣量逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、檢測1. 逆轉(zhuǎn)錄 影響因素：逆轉(zhuǎn)錄酶的活性 逆轉(zhuǎn)錄的溫度 操作的細(xì)節(jié) 如何發(fā)

4、現(xiàn)問題：質(zhì)控逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、檢測2. 擴(kuò)增、檢測 影響因素：引物、探針、儀器設(shè)備狀態(tài) 擴(kuò)增效率：結(jié)果分析定量的原理結(jié)果分析1. 標(biāo)準(zhǔn)化問題1997: 1st international Standard for HCV (96/790) 50,000 IU per vial, genotype 1a1999: 1st international Standard for HIV-1 (97/656) 100,000 IU per vial, genotype B1999: 1st international Standard for HBV (97/746) 500,000 IU per via

5、l, genotype A2000: 1st international Standard for B19 (99/800) 500,000 IU per vial2002: 1st international Standard for HAV (00/560) 50,000 IU per vial2002: 1st international Reference panel for HIV-1 Genotypes (01/466) genotypes A-H no unitage assigned2005: HBV DNA GBW(E)090031 1.03106 IU/ml HCV RNA GBW(E)090032 1.29105 IU/ml結(jié)果分析 關(guān)于IU/ml和copies/ml的換算結(jié)果分析2. 擴(kuò)增曲線的分析結(jié)果分析結(jié)果分析結(jié)果分析結(jié)果的解釋PCR可以給出我們想要的答案嗎?結(jié)果的報(bào)告解釋是