實(shí)驗八聚炳烯凝膠電泳

1、關(guān)于實(shí)驗八聚炳烯凝膠電泳第一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、實(shí)驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理2) 掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)第二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二. 基本原理(一) 電泳 電泳: 帶電顆粒在電場的作用下,向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象.(二) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 用丙烯酰胺(Acr)單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下聚合成的多孔介質(zhì).以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。第三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 1. 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性(1) 凝膠有彈性，機(jī)械性能好；幾乎無吸附和電滲作用

2、，樣品分離重復(fù)性好；(2)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度較高。(3)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(4)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系2. 凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)第五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3 凝膠聚合催化體系（1

3、）光催化：核黃素（2）化學(xué)催化：AP-TEMED 催化體系第六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)第七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復(fù)性好。聚合反應(yīng)受各種因素的影響： 催化劑和加速劑的濃度 pH 堿性條件 溫度 分子氧 雜質(zhì)第八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月4.聚丙烯酰胺凝膠種類(1) 連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類 不連續(xù)系統(tǒng):是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度

4、或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。 第九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH 6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH 8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH 8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。第十張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 1) 樣品濃縮效應(yīng) A. 凝膠孔徑不連續(xù)性 B. 緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性 C. 電位梯度的不連續(xù)性 2) 分子

5、篩效應(yīng) 3) 電荷效應(yīng)(3) 不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用第十一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月三. 實(shí)驗器材1、電泳儀,電泳槽及其附件2、培養(yǎng)皿3、搖床4、燒杯5、移液管6、微量進(jìn)樣器7、針管第十二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電 泳 裝 置電泳儀：提供直流電在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅(qū)動帶電分子的遷移第十三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月垂直平板電泳槽每組（3人）做一板膠，前后可安置兩副板，兩組共用一套電泳裝置。第十四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月四. 實(shí)驗試劑人血清；分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液 PH8.9；濃縮膠緩沖液: Tris-HCl

6、緩沖液 PH6.7；分離膠貯液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,無離子水溶解定容至100ml； 濃縮膠貯液: Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至100ml；過硫酸銨溶液（AP） 電泳緩沖液: Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3；固定染色液脫色液第十五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(一) 垂直平板電泳槽的安裝(二) 凝膠的制備(三) 加樣(四) 電泳(五) 固定和染色(六) 脫色五. 操作步驟第十六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五. 操作步驟 (一). 垂直平板電泳槽的安裝注意短玻璃板是向內(nèi)側(cè)的。第十七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月要

7、將玻板底邊平齊地壓緊在紅色橡膠條上，否則容易漏膠。第十八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 (二). 凝膠的制備1 分離膠的制備 (7%) 配8 mL (按如下順序加入）分離膠緩沖液 1 mL分離膠貯液 2 mL去離子水 4 mLTEMED 2 uL過硫酸胺（AP) 1 mL將上述試劑迅速混勻后，用滴管沿壁迅速加樣至2/3處，再取大約3 mL的水加在上面直至凝膠凝固為止。加入此物后請迅速混勻加樣，否則易凝固無法加樣凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面. 水封的目的是為了使分離膠上緣平直，并排除氣泡第十九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2.凝聚后倒出上層的高純水，可用濾

8、紙在邊緣吸水。3.濃縮膠的制備 (2.5%) 配 4 mL(按如下順序加入）濃縮膠緩沖液 0.5 mL濃縮膠貯液 1 mL去離子水 2 mL過硫酸胺（AP) 0.5 mL迅速混勻,用膠頭滴管沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到分離膠上面,直至上邊緣, 迅速插入加樣梳, 室溫靜置一段時間.加樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面貼長玻板.第二十張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠凝聚后，垂直小心拔出加樣梳，用窄條濾紙吸在玻板邊緣吸去多余的液體。第二十一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(三). 進(jìn) 樣除去底板，

9、將制膠裝置放在電泳槽內(nèi)， 加入稀釋10倍的Tris甘氨酸電極緩沖液（注意：加緩沖液先從內(nèi)槽加入，上面沒過短玻璃板，外槽液面沒過最下一個螺絲處, 加樣前要使凝膠凹形樣品槽內(nèi)的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.（用針筒將凹洞中的氣泡抽出）第二十三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月用微量進(jìn)樣器取已經(jīng)混合好的樣品 15l ，在距凝膠凹形槽底三分之一處緩緩進(jìn)樣, 每人加2個樣，兩邊各留2 孔不加樣，避免邊緣效應(yīng)。 加樣時不可過低,以防刺破膠體(三). 進(jìn) 樣第二十四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(四). 電 泳將電泳儀的正極負(fù)極與電泳槽連接（方向切勿接錯），打開電泳儀開關(guān)，開始時將電

10、壓調(diào)至150V，待樣品進(jìn)入分離膠時，將電壓調(diào)至250V。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離凝膠下端2cm時，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。第二十五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳結(jié)束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，（不要撬兩邊耳朵處，易斷裂）在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，用緩沖液沖洗膠板，將其移至大培養(yǎng)皿中染色。 剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.第二十六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(五). 固定和染色 將凝膠放入固定染色液中，使染色液剛好沒過膠板，放到搖床上，緩慢搖動，染色7 min。(注意染色液要用漏斗回收）(六). 脫 色放置搖床上，用脫色液漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去。 第二十七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月六. 實(shí) 驗 結(jié) 果可在培養(yǎng)皿下襯一白紙，便于觀察，用手機(jī)拍下凝膠圖，打印出來附在實(shí)驗報告后。第二十八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1、Acr和Bis為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作應(yīng)戴手套。2、玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與 玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時凝膠板易斷 裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格的清洗。 3、安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正， 均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏，但亦不可太用力 旋，易將玻板邊緣壓破。 4、制備濃縮膠時，注意梳齒邊緣不能