蚯蚓纖維蛋白溶解酶的提取分離純化

1、蚯蚓纖維蛋白溶解酶的提取分離純化062 第二組1 酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，動植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒有酶的催化反應(yīng)，動植物的生命也就停止了，因此對酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來，加以分離、純化，不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據(jù)不同情況區(qū)別對待。在酶的提取和純化過程中，自始至終都需要測定酶的活性，通過酶活性的測定以監(jiān)測酶的去向。 2酶的存在位置？ 存在于動植物以及微生物的細(xì)胞的各個部位 3什么是酶的提取與分離純化？ 酶的提取與分離純化是

2、指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所需要的酶制品的過程。4酶的粗提液是否只有酶，有沒有其它物質(zhì)？ 除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。因此需要根據(jù)提取酶與雜質(zhì)的性質(zhì)差別進(jìn)行分離純化。5如何將酶從粗提液中分離純化？ 要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法（利用不同蛋白質(zhì)在不同鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離），柱層析法，薄膜超濾法，親和層析法，電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之

3、一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質(zhì)的酶活性最大。 6沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集之，再溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì)，然后再經(jīng)過柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也不同，分子篩類型凝膠過濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫。對于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯度

4、溶液進(jìn)行洗脫，最方便的是線性梯度濃度，當(dāng)然用非線性梯度會得到更好的分離效果。柱層析一般都需要自動收集儀，如果能配用蛋白質(zhì)檢測儀就更好了。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣，已經(jīng)成為一種常規(guī)的酶的分離提純的步驟之一了 7近年來純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來分離、提純酶。首先選擇一支持物，如瓊脂（Sepharose）將底物、競爭性抑制劑或輔酶，以共價鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過裝有專一性底物、競爭抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再經(jīng)過充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì)，然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑

5、或輔酶的緩沖液，進(jìn)行競爭性洗脫。如果親和劑選擇合適，往往能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又最有效的一種方法。 8 蚯蚓, 俗稱地龍, 在我國入藥已有幾千年的歷史。地龍為環(huán)節(jié)動物門鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛肓毛蚓的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”,后三種習(xí)稱“瀘地龍”,主產(chǎn)于廣西、廣東、福建。性寒,味咸。清熱定驚,通絡(luò)、平喘,利尿;用于高熱神昏驚癇抽搐,關(guān)節(jié)麻痹,肢體麻木,半身不遂,肺熱喘咳,尿少水腫,高血壓癥。地龍是我國重要的中藥材之一。最早的中藥學(xué)專著神農(nóng)本草經(jīng)中收載的6 7種動物藥中就有蚯蚓。李時珍著本草綱目蟲部4 2卷中用蚯蚓入藥的處方有4 0多種。 9蚯蚓中含

6、有蚯蚓素, 酶, 維生素等多種營養(yǎng)成分, 具降壓平喘, 解熱, 利尿通絡(luò), 抗過敏, 解毒生肌,溶栓纖維及抗凝血等藥理作用。自1983年日本宮崎醫(yī)科大學(xué)美源恒極道、從蚯蚓中提取了具有較高活性的纖溶酶以來, 國內(nèi)外紛紛研究此酶, 大量實(shí)驗(yàn)證明, 該藥在動物實(shí)驗(yàn)中口服及注射均有抗栓溶栓作用。10蚯蚓構(gòu)造圖11蚯蚓纖維蛋白溶解酶的提取 將蚯蚓放在水組織搗碎機(jī)搗碎勻漿, 放入離心機(jī)進(jìn)行離心, 取出上清液, 加人丙酮產(chǎn)生沉淀, 再加人乙醚脫水, 即得粗品。12纖溶酶活檢測方法 采用纖維蛋白法側(cè)纖溶活性, 制板按Astrup法。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白, 以直徑為5mm濾紙片為樣品載體, 點(diǎn)樣6ul,35 一3

7、7度保存, 測溶圈面積, 以不同單位尿激酶的溶圈面積, 以不同單位尿激酶的溶圈面積與單位作標(biāo)準(zhǔn)曲線（ul一mm）計(jì)算樣品酶活。13蛋白質(zhì)純度的檢測 以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分離膠濃12.5%, 濃縮膠濃度為4.5%, 樣品在濃度縮膠內(nèi)時以120v電壓電泳, 樣品進(jìn)人分離膠后以250v電壓電泳。14蛋白質(zhì)濃度的檢測 以752一型紫外光柵分光光度計(jì)測其在280nm處光吸收。151、將粗酶液過2萬d及5萬d超濾膜。2、超濾后各段酶液以上述纖維酶活檢測方法中測活力得纖溶酶主活力部分在2一5萬d之間3、將超濾后2一5萬d間酶液經(jīng)濃縮5倍后上G一100柱, 以PH6.5的磷酸緩沖液洗脫,以FC一95收集63（4.2ml/管, 8秒/滴), 以752紫外光柵分光光度計(jì)測280nm處吸收情況。4、測洗脫液酶活, 得其活力部分在第2峰酶活曲線。165、將G一100柱洗脫液活力峰合并, 加人DEAE-C52柱進(jìn)一步純化, 先以PBS洗滌至下柱液A2800.03后以0.5一1.4%NaCl-PBS液梯度洗脫, 收集120管。4秒/滴、3.2ml/管、以752紫外光柵分光光度計(jì)測光吸收。6.測酶活，找出主峰活力峰，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測此峰得到條帶得以分離此蛋白