分子雜交技術(shù)

1、1、檢測受體細(xì)胞中的標(biāo)記基因是否表達(dá)，即是否表現(xiàn)出標(biāo)記基因的 性狀，從而判斷受體細(xì)胞中是否已導(dǎo)入含有目的基因的運載體。如果 檢測出標(biāo)記基因表達(dá)的性狀，說明運載體已導(dǎo)入受體細(xì)胞。2、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因，這是目的 基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。檢測方法是：采用DNA分子雜交技術(shù)。先將轉(zhuǎn)基因生物的基因組提取 出來；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作標(biāo)記做成探針；使探 針與基因組DNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因已插入染色 體DNA中。3、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)揮功 能作用的第一步。采用DNA與RNA分子雜交技術(shù)。從轉(zhuǎn)

2、基因生物中提 取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作標(biāo)記做成探針； 使探針與mRNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mR NA。4、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)， 用相應(yīng)的抗體（對抗進(jìn)行同位素標(biāo)記）進(jìn)行抗原一一抗體雜交；如果 出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。5、個體生物學(xué)水平的鑒定。如：一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫?物細(xì)胞后，是否具有了抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的接種實 驗，觀察害蟲的存活情況或植物的患病情況以確定是否具有抗性及抗 性的程度。又如：有的基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性 比較，以確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的功能中否

3、與天然產(chǎn)品相同，甚至超過天然產(chǎn)品?；パa的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜 合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可 以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。與標(biāo)祀探針條交PVDf爬屈，m蚩II質(zhì)印域尼企舔后與排記 探針散交圖2 DNA印城、RNA甲跡和蛋白質(zhì)印途示意目的基因的檢測與鑒定的補充課本Southern雜交法一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照 射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而

4、檢 測特定DNA分子的含量。Southern印跡雜交顯色圖片Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸 單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由 于核酸分子的高度特異性及檢測方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析 的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖， 或進(jìn)行目的基因序列的測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類數(shù)據(jù)資料可應(yīng)用 Southern印跡雜交技術(shù)獲得。Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個主要過程：

5、一是將待測定 核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸 纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上 的核酸同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分 子雜交過程。該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學(xué)的E.M.Southern 首創(chuàng)的，Southern印跡雜交故因此而得名。二、Northern 雜交Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對象為 RNA,其電泳在 變性條件下進(jìn)行，以去除RNA中的二級結(jié)構(gòu)，保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳 主要有3種：乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝 膠用與S

6、outhern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后與探針雜交。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技 術(shù)則被稱為 Western blot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似， 只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使 RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2-羥 基基團。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤 前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與

7、硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之 后將標(biāo)記物切下、上色、照相，樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含 5g/mlEB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的 R NA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作 為變性劑。所有操作均應(yīng)避免 RNase的污染。Western 雜交Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一

8、體的特異性蛋白質(zhì)的檢測方法。其原理是：生 物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白， 將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和 還原劑的溶液中，經(jīng)SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到 固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位 點。然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專一性結(jié)合 的帶標(biāo)記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過二抗上帶標(biāo) 記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，從而可得知被

9、 檢生物（植物）細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。Western Blot編輯本段回目錄此項技術(shù)是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)，是將已用聚丙烯酰胺凝膠 或其它凝膠或電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分仍保留抗原活性及與 其它大分子特異性結(jié)合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結(jié)合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot，第一抗體與膜上特異抗原結(jié)合后，再用標(biāo)記的二抗（同位素或非同位素的酶）來檢測，此方法可 檢測1ng抗原蛋白。Western雜交方法靈敏度高，通?？蓮闹参锟偟鞍字袡z測出50ng的特異性的目的蛋白。分子雜交技術(shù)百科名片互

10、補的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是 高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。目錄隱藏簡介核酸探針標(biāo)記的方法幾種常見的雜交編輯本段 簡介雜交的雙方是所使用探針和要檢測的 核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細(xì)胞總 DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交，即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素，但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法，多使用甾類化合物地高辛配基（digoxigenin

11、，DIG）標(biāo)記。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克 隆基因的篩選、酶場圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它 不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用，而且在臨床診斷上的應(yīng)用也日趨增多。編輯本段核酸探針標(biāo)記的方法核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為 DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否，可分為放射 性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；根據(jù)是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情 況，可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。下面將介紹各種類型的探針及標(biāo)記方法。一、雙鏈DNA探針及其標(biāo)記方法分子生物研

12、究中，最常用的探針即為雙鏈 DNA探針，它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種：切口平移法和隨機引物合成法。1.切口平移法（nick translation）當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時，E.coli DNA聚合酶I就可 將核苷酸連接到切口的3羥基末端。同時該酶具有從5一3的核酸外切酶活性，能從切口的5端除去核苷 酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的 3端補上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸 代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨?。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響：（

13、a）產(chǎn)物的比活性取決于a-32 PdNTP的比活性和模板中 核苷酸被置換的程度。（b） DNA酶I的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。（c） DN A模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性，故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。材料：待標(biāo)記的DNA。設(shè)備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：10 x 切 口平移緩沖液:0.5mol/L TrisCl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100pg/ml BSA。未標(biāo)記的dNTP原液:除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外，其余3種分別溶解于50mmol/L Tris C l (pH7.5)溶液

14、中，濃度為 0.3mmol/L。a-32 P dCTP 或a-32 PdATP:400 Ci/mmol, 10pCi/pl oE.coli DNA 聚合酶 I (4 單位巾 l):溶于 50p g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L T ris- Cl(pH7.5)中。DNA 酶 I :1mg/ml oEDTA :200mmol/L (pH8.0)。 10mol/L NH4Ac。操作步驟：按下列配比混合：未標(biāo)記的dNTP 10pl10 x切口平移緩沖液5pl待標(biāo)記的DNA 1pga-32 PdCTP 或 dATP(70pCi) 7plE.coli DNA聚合

15、酶4單位DAN酶I 1加水至終體積50pl置于15 C水浴60分鐘。加入5pl EDTA終止反應(yīng)。反應(yīng)液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L,加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀回收 DNA探針。 注意1、3H, 32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用a-32 P-dNTP。2、DNA酶I的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶I活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。隨機引物合成法 隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產(chǎn)物平均長度為4

16、00-600個核苷酸。利用隨機引物進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點是：(1)Klenow片段沒有5-3外切酶 活性，反應(yīng)穩(wěn)定，可以獲得大量的有效探針。(2)反應(yīng)時對模板的要求不嚴(yán)格，用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也 可進(jìn)行反應(yīng)。(3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高，可達(dá)4x109 cpm/pg探針。(4)隨機引物反應(yīng)還可以在低熔點瓊脂 糖中直接進(jìn)行。材料：待標(biāo)記的DNA片段。設(shè)備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：隨機引物(隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA)。10 x 隨機標(biāo)記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。Klenow 片段。20mmol/L DTT o未標(biāo)記的dN

17、TP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。a-32 P dATP:比活性 3000Ci/mmol, 10pCi/pl o緩沖液 A： 50mmol/L Tris Cl (pH7.5) ; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0 ) ; 0.5% SDS。操作步驟：200ng雙鏈DNA(1M)和 7.5ng隨機引物(1pl)混合后置于eppendorf管內(nèi)，水浴煮沸5分鐘后，立 即置于冰浴中1分鐘。與此同時，盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內(nèi)混合下列化合物：20mmol/L DTT 1pl未標(biāo)記的dNTP溶液1叫10X隨機標(biāo)記

18、緩沖液1叫a-32 P dATP(比活性 3000Ci/mmol; 10pCi/pl) 3plddH2O 1pl將步驟(l)eppendorf管中的溶液移到步驟 管中。加入5單位(約1pl) Klenow片段，充分混合，在微型離心機中以12000g離心1-2秒，使所有溶液 沉于試管底部，在室溫下保溫3-16小時。在反應(yīng)液中加入10pl緩沖液A后,將放射性標(biāo)記的探針保存在-20C下備用。同時計算放射比活性。注意1、引物與模板的比例應(yīng)仔細(xì)調(diào)整，當(dāng)引物高于模板時，反應(yīng)產(chǎn)物比較短，但產(chǎn)物的累積較多； 反之，則可獲得較長片段的探針。2、模板DNA應(yīng)是線性的，如為超螺旋 DNA，則標(biāo)記效率不足50%。二、

19、單鏈DNA探針用雙鏈探針雜交檢測另一個遠(yuǎn)緣 DNA時，探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之 間的配對卻十分穩(wěn)定，即形成自身的無效雜交，結(jié)果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單 鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:(1)以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針； (2)以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬?；?M13噬 菌體載體中，以此為模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物，在a-32P-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射標(biāo)記探針，

20、反應(yīng)完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內(nèi)或下游用限制性內(nèi) 切酶切割這些長短不一的產(chǎn)物，然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。 雙鏈RF型M13 DNA也可用于單鏈DNA的制備，選用適當(dāng)?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇?fù)鏈單鏈探針。材料：已制備好的單鏈DNA模板(方法參見第十章中有關(guān)內(nèi)容)。設(shè)備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：10 x Klenow 緩沖液：0.5mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。0.1mol/L DTT 溶液。a-32 P dATP: 3000Ci/mmol, 10pCi/pl o40m

21、mol/L和20mmol/L的未標(biāo)記的dNTP溶液。dCTP，dTTP，dGTP 各 20mmol/L 的溶液。Klenow 片段(5 單位 /ml)。適宜的限制酶，如EcoR I、Hind III等。0.5mol/L EDTA (pH8.0 )。操作步驟：(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：單鏈模板(約0.5pmol ) 1mg適當(dāng)引物 5pmol10 xKlenow 緩沖液 3ml加水至20ml將eppendorf管加熱到85C 5分鐘，在30分鐘內(nèi)，使小離心管降到37C；依次加入：DTT 2mla-32PdATP 5ml未標(biāo)記的dATP 1mldGTP,dCTP,dT

22、TP 混合液 1ml混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。加1ml (5單位)Klenow酶室溫下30分鐘。加1ml20mmol/L未標(biāo)記的dATP溶液20分鐘。68 C加熱10分鐘，使Klenow片段失活。調(diào)整NaCl濃度，使之適宜于酶切。加入20單位限制性內(nèi)切酶(如 EcoR I , Hind III等)酶切1小時。酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度10mmol/L。用電泳方法分離放射性標(biāo)記的探針。2.從RNA合成單鏈cDNA探針cDNA單鏈探針主要用來分離cDNA文庫中相應(yīng)的基因。用RNA為 模板合成cDNA探針?biāo)玫囊镉袃煞N：

23、(1)用寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A) 的mRNA,并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于 mRNA 3末端序列。(2)可用隨機引物合成cDNA探針。該法 可避免上述缺點，產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板 RNA中通常含有多種不同的RNA分子，所得探針的 序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜得多，應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA中的目的序列。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段，經(jīng)Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。材料：已提純的RNA或mRNA設(shè)備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：合適的引物：隨機引物或olig

24、o(dT)15-18。5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。a-32PdCTP(3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。反轉(zhuǎn)錄酶(200000單位/ml)。100mmol/L DTT。250mmol/L MgCl2。1mol/L KCl。0.5mol/L EDTA (pH8.0)。10% SDS。RNasin(40 單位/ml)。操作步驟：在已置于冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：RNA 或 mRNA 10.0ml合適的產(chǎn)物(1mg/ml) 10.0ml1mol/L Tris- Cl(pH7.6) 2.5ml1mol/L KCl 3.5ml250mmol/L MgC

25、l2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0mla-32PdCTP 10.0ml0.1mol/L DTT 2.0mlRnasin 20U加水至48ml反轉(zhuǎn)錄酶(200000單位/ml) 2ml混勻后，稍稍離心，37C保溫2小時。反應(yīng)完畢后加入下列試劑：0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml加入3ml 3mol/L NaOH。68 C保溫30分鐘以水解RNA。冷卻至室溫后，加入 10ml 1mol/L Tris- Cl (pH7.4)?；靹?。然后加入 3ml 2mol/L HCl。酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱層析或乙醇沉淀法分離標(biāo)記的探

26、針。注意RNA極易降解，因而實驗中的所有試劑和器皿均應(yīng)在 DEPC處理后，滅菌備用。三、末端標(biāo)記DNA探針現(xiàn)以Klenow片段標(biāo)記3末端為例說明末端標(biāo)記的方法。1、材料：待標(biāo)記的雙鏈含凹缺 3末端的DNA。2、設(shè)備：高速臺式離心機，水浴鍋等。3、試劑：3種不含標(biāo)記的dNTP各為200mmol/L。合適的限制酶。a-32P dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。Klenow 片段(5U/ml)。10 x 末端標(biāo)記緩沖液:0.5mol/L Tris- Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml B SA。4、操作步驟：25pl

27、反應(yīng)體系中用合適的限制酶酶切1凹 的DNA。按下列成分加入試劑并混勻：已酶切的DNA 1mg (25ml) 10 x末端標(biāo)記緩沖液5ml 2mmol/L 3種 dNTP 1ml a-32P-dNTP 適量加水至 50ml加入1單位的Klenow片段，室溫下反應(yīng)30分鐘。加入1ml 2mmol/L第四種核苷酸溶液，室溫保溫15分鐘。70 C加熱5分鐘，終止反應(yīng)。用酚/氯仿抽提后，用乙醇沉淀來分離標(biāo)記的DNA,或用Sephdadex G-50柱層析分離標(biāo)記的DNA。注意1、 利用本方法可對DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DN A片段。2、對DNA的純度不很嚴(yán)格，

28、少量制備的質(zhì)粒也可進(jìn)行末端標(biāo)記合成探針。3、 末端標(biāo)記還有其他的一些方法，如利用 T4多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的5端突出的DNA和平末端凹 缺DNA分子，也可利用該酶進(jìn)行交換反應(yīng)標(biāo)記 5末端。四、寡核昔酸探針利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種：單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準(zhǔn)確配對，可以準(zhǔn)確地設(shè)計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非 完全配對序列雜交，對于一些未知序列的目的片段則無效。1、材料：待標(biāo)記的寡核苷酸(10pmol/pl)。2、設(shè)備：高速離式

29、離心機，恒溫水浴鍋等。3、試劑：10 xT4 多核苷酸激酶緩沖液:0.5mol/L Tris Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1m mol/L Spermidine HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。 -82 P ATP(比活性 7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。T4多核苷酸激酶(10單位/ml)。4、操作步驟：100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65C變性5分鐘，迅速置冰溶中。立即加入下列試劑：10X激酶緩沖液5mlg-32PATP(比活性 7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10mlT4多核苷酸激

30、酶2ml加水至50ml混勻后置37C水浴20分鐘。再加入20單位T4多核苷酸激酶，置37C水浴20分鐘后立即置冰浴中。Sephadex G-50 柱層析。此方法是在每個探針的5末端多加了一個磷酸，理論上，這會影響其與DNA的雜交。因此，建議使用Klenow DNA聚合酶的鏈延伸法獲得高放射性的寡核苷酸探針。除了常見的同位素標(biāo)記探針外，還有利用非同位素標(biāo)記探針和雜交的方法，許多公司都有不同的非同 位素標(biāo)記探針的雜交系統(tǒng)出售，可根據(jù)這些公司所提供的操作步驟進(jìn)行探針的標(biāo)記和雜交。五、RNA探針許多載體如pBluescript, pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子，

31、它們能 特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于 DNA的RNA聚合酶所識別，合成特異性的RNA。在反應(yīng)體系中若加 入經(jīng)標(biāo)記的NTP，則可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈，它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點，又具有許 多DNA單鏈探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點，主要是：RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性，所以在 雜交反應(yīng)中RNA探針比相同比活性的DNA探針?biāo)a(chǎn)生信號要強。RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比 S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制，所以用RNA探針進(jìn)行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果好。噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的rNTP濃度比Klenow片段所需的dNTP濃度低，因而能

32、在較低 濃度放射性底物的存在下，合成高比活性的全長探針。 用來合成RNA的模板能轉(zhuǎn)錄許多次，所以RNA的 產(chǎn)量比單鏈DNA高。并且用來合成RNA的模板能轉(zhuǎn)錄多次，可獲得比單鏈 DNA更高產(chǎn)量的RNA。反應(yīng)完畢后，用無RNA酶的DNA酶I處理，即可除去模板DNA，而單鏈DNA探針則需通過凝膠電泳 純化才能與模板DNA分離。另外噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細(xì)菌、質(zhì)粒或真核生物的啟動子， 對模板的要求也不高，故在異常位點起始RNA合成的比率很低。因此，當(dāng)將線性質(zhì)粒和相應(yīng)的依賴 DNA的 RNA聚合酶及四種rNTP 一起保溫時，所有RNA的合成，都由這些噬菌體啟動子起始。而

33、在單鏈DNA探針 合成中，若模板中混雜其他DNA片段，則會產(chǎn)生干擾。但它也存在著不可避免的缺點，因為合成的探針是R NA，它對RNase特別敏感，應(yīng)而所用的器皿試劑等均應(yīng)仔細(xì)地去除RNase ；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA會合成極長的RNA，它有可能帶上質(zhì)粒的序列而降低特異性。編輯本段幾種常見的雜交分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子 雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的 DNA或RNA分子所處的位置。根據(jù)被測定的對象，分子雜交基本可分為以 下幾大類：Southern雜交:DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，

34、然后與探針 雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。Northern雜交:RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后用探針雜交。被檢對象 為RNA,探針為DNA或RNA。根據(jù)雜交所用的方法，另外還有斑點(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3種固相支持體 可用于雜交：硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和 Whatman 541濾紙。不同商標(biāo)的尼龍膜需要進(jìn)行不同的處理， 在DNA固定和雜交的過程中要嚴(yán)格按生產(chǎn)廠家的說明書來進(jìn)行。Whatman 541濾紙有很高的濕強度，最早用于篩選細(xì)菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫。固定化 DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維 素濾

35、膜時所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優(yōu)點：它更便宜，雜交中更 耐用，干燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心，雜交信號的強度會明顯弱于用硝酸纖維素濾 膜時所得到的信號強度。因此，常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。一、Southern 雜交Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的 DNA片段中是否存在與探針同源的序列，它包括 下列步驟：酶切DNA,凝膠電泳分離各酶切片段，然后使DNA原位變性。將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。預(yù)雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。讓探針與同源DNA片段雜交

36、，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。通過顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素，包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大 小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的 DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條件下，放射自顯影 曝光數(shù)天后，Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32 P標(biāo)記的高比活性探針的(109 cpm/pg) 互補DNA。如果將10pg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交 ，曝光過夜，則 可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有 3種:(1)毛細(xì)管

37、轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明， 故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點是簡單，不需要用其他儀器。缺點是轉(zhuǎn)移時間較 長，轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后，可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點是 不需要脫嘌吟/水解作用，可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點是轉(zhuǎn)移中電流較大，溫度難以控制。通常只有 當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無效時，才采用電泳轉(zhuǎn)移。(3)真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器，它們一 般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上，緩沖液從上面的一個貯液 槽中流下，洗脫出凝膠中的DNA，使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點是快速

38、，在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5 mm)和正常瓊脂糖濃度(2.3kb)轉(zhuǎn)移的速度和效率。此外，堿可 以除去mRNA分子的乙二醛加合物，免去固定后洗脫的步驟。乙醛酰 RNA在堿性條件下轉(zhuǎn)移至帶正電荷 尼龍膜的操作也按DNA轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行，但轉(zhuǎn)移緩沖液為 7.5mmol/LNaOH，轉(zhuǎn)移結(jié)束后(4.5-6.0小時)， 尼龍膜需用2xSSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室溫晾干。尼龍膜的不足之處是背景較高，用RNA探針時尤為嚴(yán)重。將濾膜長時間置于高濃度的堿性溶液中，會導(dǎo)致雜交背景明顯升高，可通過提高預(yù)雜交和雜交步驟中有關(guān)阻斷試劑的量來予以解決。如用中性緩沖液進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將晾干的尼龍

39、膜夾在兩張濾紙中間,80C干烤0.5-2小 時，或者254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶 RNA的一面。后一種方法較為繁瑣，但卻優(yōu)先使用，因為某些批 號的帶正電荷的尼龍膜經(jīng)此處理后，雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果，務(wù)必確保尼龍膜不被過度照 射，適度照射可促進(jìn)RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，而過度照射卻使RN A上一部分胸腺嘧啶共價結(jié)合于尼龍膜表面，導(dǎo)致雜交信號減弱。三、菌落原位雜交對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落(100-200 )進(jìn)行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸 并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，

40、對菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于 4C直至得到篩選結(jié)果。1、材料：待檢測的細(xì)菌平皿，已標(biāo)記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。2、設(shè)備：恒溫烤箱，恒溫水浴，臺式高速離心機等。3、試劑：LB固體培養(yǎng)基。0.5mol/L NaOH。1mol/L Tris- Cl o1.5mol/L NaCl。0.5mol/L Tris- Cl o預(yù)洗液：5xSSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。預(yù)雜交液：50%甲酰胺，6xSSC (或6xSSPE), 0.05xBLOTTO(甲酰胺可不用)。其余試劑：與Southern雜交相同。4、操作步驟：將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上：在含有選擇性

41、抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上，再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。 應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種(或打點)。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主 平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒(如 pBR322)的菌落。倒置平板，于37C培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到 0.5-1.0mm的寬度。用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂，在3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放于4C,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。裂解細(xì)菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖

42、維素濾膜。菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上，將濾膜放到小洼上 展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于原處2-3分鐘。用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris- Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜，再重 復(fù)一次該步驟。吸干濾膜，把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris- Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸 干濾膜，轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，置于室溫2

43、0-30分鐘,使濾膜干燥。將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80C干烤2小時，固定DNA。將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)記的探針雜交。5 .雜交盛有2xSSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上，徹底浸濕5分鐘。將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起，放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿，放到 位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺上。于 50C處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中，應(yīng)緩緩搖動濾膜，防止 它們粘在一起。用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片，以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號 的強度和清晰度。將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中，在適宜溫度(即在水溶液中雜交

44、時用68C,而在50% 甲酰胺中雜交時用42C)下，預(yù)雜交1-2小時。將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100 C加熱5分鐘，迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探 針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。雜交結(jié)束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2xSSC和0.1% SDS溶液 中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時應(yīng)避免膜干涸。68 C用300-500ml 1xSSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進(jìn)行放射自顯 影。如背景很高或?qū)嶒炓髧?yán)格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2x

45、SSC和0.1% SDS的溶液于68C將濾 膜浸泡60分鐘。把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后，把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上，并在保鮮膜上作幾個不 對稱的標(biāo)記，以使濾膜與放射性自顯影片位置對應(yīng)。用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加 X光片并加上增感屏于-70C曝光12-16小時。底片顯影后，在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號的位置，同時在不對稱分布點 的位置上作出標(biāo)記。可從底片上取下透明紙，通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。四、斑點雜交斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣 品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋，還可以得到半定量的結(jié)果。所以它是 一種簡便、快速、經(jīng)濟的分析 DNA或RNA的方法，在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到，是研究基因表達(dá)的 有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離，不能了解目的序列的長度。尤其當(dāng)本底干擾較高時，難以 區(qū)分目的序列信號和干擾信號。1、材料：待分析的DNA或RNA樣品