wy第七章生物技術(shù)育種

1、第一節(jié) 組織與器官培養(yǎng)第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)與單倍體育種第三節(jié) 細胞培養(yǎng)及其突變體篩選第四節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交第七章 生物技術(shù)育種是以生命科學為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計、構(gòu)建、培育具有預期性狀的新物種、新品種、新品系，以及與工程原理相結(jié)合，進行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務的綜合技術(shù)體系。 目前用于茶樹育種的現(xiàn)代生物技術(shù)有組織和器官培養(yǎng)技術(shù)、花粉（藥）培養(yǎng)和單倍體培育技術(shù)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交技術(shù)等。廣義的生物技術(shù)也包括分子標記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。生物技術(shù)：第一節(jié) 組織與器官培養(yǎng)一、組織與器官培養(yǎng)的概念 植物組織與器官培養(yǎng)是建立在植物細胞全能性學說的理論基礎(chǔ)上，以無菌操作

2、作為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。 廣義的植物組織細胞培養(yǎng)是指將離體的植物體各種結(jié)構(gòu)（如原生質(zhì)體、細胞、組織、器官以及幼小植株），即外植體在無菌的人工環(huán)境中使其生長發(fā)育，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。（1）組織培養(yǎng)指以植物各部分的組織（如分生組織、形成層組織、表皮組織、薄壁組織和各器官的組織）作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。（2）器官培養(yǎng)指以植物的某一器官的全部或部分器官原基作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。常有根尖、莖尖、莖段、莖的切塊、葉片、花瓣、花蕾、花托、子房、子葉以及未成熟的果實等。B. 花粉與花藥培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)通常是指以未成熟花粉作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。

3、花藥培養(yǎng)通常是指以未成熟花藥作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。A. 胚胎培養(yǎng)它包括胚（幼胚、成熟胚）培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)以及試管受精等。（3）細胞培養(yǎng)指以能保持較好分散性的單細胞或很小的細胞團作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。（4）原生質(zhì)體培養(yǎng)指以除去細胞壁而獲得的原生質(zhì)作為外植體的離體培養(yǎng)技術(shù)。二、組織與器官培養(yǎng)在育種中的應用（1）擴大變異范圍經(jīng)過原生質(zhì)體的融合途徑給實現(xiàn)種間或?qū)匍g甚至科間廣泛雜交以極大的促進作用。（2）克服遠緣雜交的一些障礙如果在無菌條件下進行幼胚剝離和人工培養(yǎng)，使其繼續(xù)發(fā)育，便有可能獲得真正的雜種。（3）獲得體細胞雜種 經(jīng)過原生質(zhì)體的融合途徑，給實現(xiàn)種間或?qū)匍g甚至科間廣泛雜

4、交以極大的促進作用。（4）倍性控制 通過對胚胎、器官及細胞培養(yǎng)，可以實現(xiàn)對再生植株的倍性控制。另外，在植物組織細胞培養(yǎng)周期中進行染色體加倍是開展多倍體育種的有效方法，通?？梢员苊猱a(chǎn)生嵌合體。通過花藥及花粉培養(yǎng)再生單倍體植株，經(jīng)過選擇再使優(yōu)良的單倍體植株的染色體加倍，便可獲得純合穩(wěn)定的二倍體植株。（5）快速無性繁殖快速周期短、繁殖數(shù)量大、不受季節(jié)和環(huán)境條件的限制、適合進行工廠化生產(chǎn)、防止苗木帶病退化等優(yōu)點。這也是今后茶樹繁殖方式的一個發(fā)展方向。（6）獲得脫毒苗由于病毒是通過維管束傳導的，如果利用尚未分化維管束的莖尖或其他分生組織進行離體培養(yǎng)，就有可能獲得脫病毒的試管苗。（7）種質(zhì)資源的保存利用莖

5、尖及細胞培養(yǎng)結(jié)合低溫或超低溫冷凍貯藏來保存種質(zhì)資源已引起科學家極大重視。（8）作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)三、培養(yǎng)的步驟與方法無菌培養(yǎng)的建立茶樹組織中存在種類眾多的內(nèi)生菌，給茶樹組織培養(yǎng)造成不利影響內(nèi)生真菌的分布具有明顯的組織?；匀~片在成熟過程中，內(nèi)生細菌逐漸減少，而內(nèi)生真菌逐漸增多，表現(xiàn)為較有規(guī)律的內(nèi)生菌種類交替。無菌培養(yǎng)建立過程：外植體的選擇滅菌接種培養(yǎng)等（1）取材（外植體）選用外植體時應考慮供體植株的生理狀況及所取的部位，盡管每個器官或組織均可作為外植體，但成功的難易程度有所不同較大的外植體有較強的再生能力，而小的則弱如果離體培養(yǎng)的目的只是快速繁殖，開始作為外植體的植物組織和器官可以相對

6、大一些。A. 胚及相關(guān)材料B. 莖尖及相關(guān)材料C. 葉片（2）滅菌最佳的滅菌方式是70%乙醇處理30 s，0.1%氯化汞溶液浸泡10 min。滅菌后的外植體用無菌蒸餾水沖洗，洗凈殘留在外植體上的滅菌藥劑。既要達到滅菌的目的，又不能讓外植體細胞大量死亡滅菌藥劑的種類和濃度，滅菌時間會影響滅菌效果和外植體的生長（3）培養(yǎng)基從愈傷組織形成芽還是根，主要決定于生長素與細胞激動素的相對濃度誘導培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基分化：愈傷組織再分化成苗的過程植物組織中的多酚氧化酶被激活，產(chǎn)生醌類物質(zhì)，擴散到培養(yǎng)基后，會抑制其他酶的活性，從而影響外植體的培養(yǎng)。外植體褐變的原因：a. 基因型b. 生理狀態(tài)c. 培養(yǎng)基成份d.

7、培養(yǎng)條件不當影響外植體褐變的因素： 在培養(yǎng)基中添加一定濃度和比例的植物生長調(diào)節(jié)劑，如細胞分裂素和生長素類。除應考慮外植體能夠存活，還應考慮接種的外植體能夠較快生長a. 選擇合適的外植體b. 避免過度滅菌c. 使用抗氧化劑或吸附劑d. 合適的培養(yǎng)條件并及時分割轉(zhuǎn)接克服外植體褐變的措施：影響離體培養(yǎng)增殖率的重要因素主要有培養(yǎng)基的種類及添加成分，尤其是培養(yǎng)基中的添加植物激素種類和濃度1. 誘導腋芽發(fā)生 2. 誘導產(chǎn)生不定芽或新梢3. 體細胞胚胎發(fā)生營養(yǎng)繁殖體的增殖 營養(yǎng)繁殖體增殖階段的目的是使繁殖體實現(xiàn)最大限度地增殖本階段還包括對再生的完整植株進行馴化鍛煉，使其逐漸適應外界的自然環(huán)境。生根這個階段的

8、目的是使在第二階段誘導的無根或根系很弱的新梢形成根系，從而獲得完整植株。生根階段要求的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件與前述兩階段稍有不同。誘導不定根的產(chǎn)生大多只需要在培養(yǎng)基中添加一些促進生根的生長激素，對于細胞分裂素類，一般都不再需要。在誘導生根階段，適當提高光照強度和延長光照時間對生根是有利的，而且還會提高以后試管植株移盆缽的成活率。試管苗移栽大田本階段的主要目的是提高移栽成活率。當將馴化后的試管苗移栽大田時，面臨的最主要問題是會出現(xiàn)組織失水和病菌感染。在移栽初期，應保持土壤適當?shù)臐穸?，切忌水分過多，植株出現(xiàn)輕度失水時，可噴霧解決。其次，是如何使其由異養(yǎng)為主轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆责B(yǎng)狀態(tài)，方法是使移栽小苗經(jīng)過一段

9、生長后，逐漸適應自然光照。單倍體在植物育種上的重要性凡具有配子染色體數(shù)目的植物便稱為單倍體植物。單倍體不等于一倍體，嚴格地說是一個半倍體。（1）單倍體染色體加倍可獲得純合二倍體第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)與單倍體育種（2）有利于遠緣雜交新類型的培育和穩(wěn)定 （3）與誘變育種相結(jié)合可加速育種進程 （4）作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)基本程序： 外植體（花蕾）選擇（一）花藥培養(yǎng)外植體預處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導培養(yǎng)分化培養(yǎng)移栽需考慮三方面問題：（1）取材A. 外植體的基因型花藥應來自性狀優(yōu)良的雜交親本雄核發(fā)育處于單核中晚期的花藥a. 盡量避免損傷花藥B. 外植體的生理狀態(tài)C. 花粉的發(fā)育

10、時期（2）滅菌（3）接種b. 徹底去除花絲部分兩種途徑：（3）再生A. 胚狀體再生途徑B. 愈傷組織再生途徑（4）移栽 把成苗的單倍體植株或染色體加倍后的純合二倍體試管苗，轉(zhuǎn)移到滲透壓較低而無生長素等物質(zhì)的培養(yǎng)基上，直到根、莖、葉生長都較正常和健壯時，移出進行沙培或土培。通過花藥培養(yǎng)途徑所獲得的植株不只是來源于花粉，還有來源于花藥壁、絨氈層等不同部位的體細胞，造成所獲得的植株群體既有單倍體，又有二倍體、甚至多倍體，給以后的鑒定及利用帶來困難。（二）花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)則可以完全使誘導形成的植株全部來源于單倍體的花粉，但是花粉培養(yǎng)所要求的技術(shù)比花藥培養(yǎng)復雜，許多不明的因素有待研究。單倍體植株的染色體

11、加倍（一）自然加倍（二）人工誘導加倍 （三）從愈傷組織再生二倍體植株 在誘導形成單倍體植株的過程中，需要注意的是，在花藥培養(yǎng)時，要區(qū)分由花藥壁、花絲等親本二倍性愈傷組織分化的植株與真正由花粉分化而自然加倍的植株。常用的方法是利用秋水仙堿處理 切取單倍體植株的莖、葉等組織進行培養(yǎng)，使其通過愈傷組織、器官分化途徑再生植株。單細胞培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)是指從植物組織器官或愈傷組織游離出單細胞，在無菌條件下，使其再生完整植株的技術(shù)。第三節(jié) 細胞培養(yǎng)及其突變體篩選包括兩種含義，即單個細胞培養(yǎng)和單離細胞培養(yǎng)或游離細胞培養(yǎng)。游離細胞有時不只有單細胞，可能也存在少量的小細胞團。單細胞培養(yǎng)不是只停留在增殖階段，而是可被

12、誘導在分化，直至形成完整植株。分離細胞的方法物理方法酶法 先將植物組織器官等外植體接種到固體培養(yǎng)基上，讓其形成質(zhì)地疏松的愈傷組織，再將愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經(jīng)搖床振蕩使細胞分散，然后用鎳絲網(wǎng)過濾，除去細胞團，過濾后離心，使分離的細胞沉淀而收集。果膠酶和纖維素酶可以使細胞彼此分離開來單細胞培養(yǎng)方法（1）液體淺層培養(yǎng)（5）條件培養(yǎng)（4）看護培養(yǎng)（3）平板培養(yǎng)（2）微滴培養(yǎng)培養(yǎng)細胞的密度及活力的測定（1）起始培養(yǎng)的細胞密度 植板率用來反應植板效率的高低，其含義是每個平板接種細胞總數(shù)形成細胞團的百分率 單離細胞并不全是活的，細胞活力測定有助于評價細胞質(zhì)量，同時對以后的培養(yǎng)效率也有較正確的估計（3）

13、植板率的測定（2）細胞的活力測定細胞突變體篩選細胞突變體篩選的一般技術(shù)（1）細胞材料的選擇c. 選用生長速度相對較快的細胞系需注意三方面問題：a. 起始材料要較易再生植株b. 選用染色體數(shù)穩(wěn)定的材料（2）誘發(fā)突變體的方法 物理誘變：如紫外線、放射線等化學誘變：化學誘變劑，包括甲基磺酸乙酯（EMS）、天然堿基類似物和吖啶類物質(zhì)等（3）突變細胞的選擇方法直接選擇法（正選擇法）：間接選擇法：將大量細胞置于有選擇劑的培養(yǎng)基上，使正常細胞不能生長，而抗選擇條件的突變細胞能夠生長，從而達到選擇的目的用于難以或不能用直接選擇法分離的突變型突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定 鑒別經(jīng)選擇出來的細胞是否為突變細胞，

14、常用的方法是除去選擇劑，讓細胞或組織在沒有選擇劑的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)幾代。如果仍能表現(xiàn)選擇出來的變異性狀的，便可基本確認為突變細胞或組織。 鑒別變異細胞及組織再分化形成的植株是否為突變植株時，可用再生的植株開花結(jié)實后所獲得的發(fā)芽種子或用種子長成的植株為材料，進一步誘導其形成愈傷組織，將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如果仍能表現(xiàn)變異性狀的，即可認為這些再生植株為突變植株。如果所選擇的突變性狀是可以在植株個體水平表達的性狀時，例如抗病性等，也可以用再生植株本身進行鑒定。農(nóng)業(yè)上有用性狀的突變體離體篩選 （1）抗性突變體抗病性常用的選擇劑：活菌選擇劑和病菌毒素選擇劑抗除草劑和抗寒性 （

15、2）育性突變體 （3）營養(yǎng)缺陷型突變體 （4）各種形態(tài)特征和生物學特性突變體植物原生質(zhì)體：第四節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交原生質(zhì)體融合（細胞雜交）：指除去細胞壁由質(zhì)膜包裹著的具有生活力的植物裸細胞。它含有該個體的全部遺傳信息，而且具有再生出與其親本完全相同個體的潛力。 使不同植物的原生質(zhì)體互相融合形成雜種細胞，再經(jīng)過人工培養(yǎng)誘導雜種細胞分化形成植株的過程原生質(zhì)體的分離用葉片分離原生質(zhì)體時，選用成熟葉片或生理活性稍微衰退的過熟葉，有利原生質(zhì)體的分離以及培養(yǎng)再生植株。試管苗的子葉、胚軸以及培養(yǎng)的懸浮細胞，具有無菌、不受生長季節(jié)影響等特點。（一）分離原生質(zhì)體的材料從植物的各個部位幾乎均能分離出原生質(zhì)

16、體。最常用的是葉肉組織、無菌苗的子葉以及由植物組織器官形成的愈傷組織及懸浮細胞。預處理的方法：（二）原生質(zhì)體的分離（1）材料的預處理提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和代謝活力；逐步降低植物細胞水勢，增強原生質(zhì)體對培養(yǎng)基高滲透壓的適應；使游離的原生質(zhì)體更能適應新的培養(yǎng)條件目的：預培養(yǎng)暗處理藥物或添加劑處理萎蔫處理更新培養(yǎng)基目前一般采用酶法。常使用商品化的酶制劑，其中包括纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。（2）原生質(zhì)體的分離在配制酶液時，必須加入適量的滲透壓穩(wěn)定劑，保持一定的滲透壓，以代替細胞壁對原生質(zhì)體起保護作用。因為細胞壁一旦被去掉，裸露的原生質(zhì)體若處于內(nèi)外滲透壓不同的溶液中將可能立即破裂。甘露醇和山犁醇是常用

17、的滲透壓穩(wěn)定劑，有時也用葡萄糖。酶液的pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力有很大影響原生質(zhì)體的培養(yǎng)（一）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件植物激素光照和溫度原生質(zhì)體的密度2,4-D是用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的最普遍的生長調(diào)節(jié)劑，而細胞分裂素對誘導原生質(zhì)體細胞的分裂是不需要的。一般采用103個/ml以上的密度。培養(yǎng)的原生質(zhì)體一開始應在黑暗中培養(yǎng)，葉肉原生質(zhì)體再生初期以散射光為宜。當原生質(zhì)體再生成愈傷組織時，需要強光照。（二）原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 單細胞培養(yǎng)的各種方法均適用原生質(zhì)體的培養(yǎng)，其中最常用的是液體淺層培養(yǎng)和平板培養(yǎng)兩種方法。細胞分裂細胞壁再生分為三個階段：（三）原生質(zhì)體的培養(yǎng)過程植株再生原生質(zhì)體的融合（一）原生質(zhì)體融合的類型自

18、發(fā)融合誘導融合指植物組織和細胞在用酶分離原生質(zhì)體過程中同種原生質(zhì)體自然融合，形成同核體。這對于以植物育種為目的的體細胞雜交而言，是沒有應用價值的。指分離原生質(zhì)體以后，通過加入誘導劑或其他方法促進不同親本的異種原生質(zhì)體之間發(fā)生融合的過程。誘導融合可以在兩種（包括種內(nèi)，種間、屬間、科間甚至界間）原生質(zhì)體之間進行。（二）原生質(zhì)體融合的方式對稱融合非對稱融合指種內(nèi)和種間完整原生質(zhì)體的融合，可產(chǎn)生核與核、胞質(zhì)與胞質(zhì)間重組的對稱雜種，并可發(fā)育為遺傳穩(wěn)定的異源雙二倍體雜種植株是用物理和化學的方法處理親本原生質(zhì)體，使一方細胞質(zhì)失活，或使另一方胞質(zhì)基因失活，再進行原生質(zhì)體融合，其融合后代只具有一方親本的細胞核，

19、形成不對稱雜種。（三）誘導融合的方法物理方法化學方法電融合：用改變電場的方法誘導原生質(zhì)體的融合用一些化學試劑作為誘導劑，處理原生質(zhì)體使其發(fā)生融合（1）高pH高鈣法（2）多聚化合物法原生質(zhì)融合體的發(fā)育及雜種細胞的篩選（一）原生質(zhì)融合體的生長發(fā)育產(chǎn)生可育的體細胞雜種植株比較困難的原因：a. 大多數(shù)作物的原生質(zhì)體還不能再生成植株b. 大多數(shù)體細胞雜種植株的染色體不穩(wěn)定，出現(xiàn)了非整倍體植株，有性生殖時是不孕的c. 種間的有性生殖不親和性限制了體細胞的不親和性植物原生質(zhì)體發(fā)育主要經(jīng)歷以下4個過程：（1）異核體的壁再生融合的原生質(zhì)體必須使異核體重新長出新的共同的細胞壁，異核體才能進行分裂，這個過程稱為原生質(zhì)體再生 一種是雙親細胞核在異核細胞中迅速實現(xiàn)同步有絲分裂，形成共同紡錘體，全部染色體都排列在赤道板上，進行正常的細胞分裂而產(chǎn)生子細胞，在子細胞的細胞核中含有雙親細胞的染色體及其攜帶的遺傳物質(zhì)，完成了真正的核融合；另一種是雙親細胞核有絲分裂不能同步或同步性不好，造成異核體不能發(fā)生真正核融合，導致雙親或雙親之一的染色體被排除或出現(xiàn)畸形。（2）異核體的核融合 通過持續(xù)的細胞分裂，逐步形成肉眼可