基因工程藥物研發(fā)的基本過(guò)程

1、基因工程藥物研發(fā)的基本過(guò)程基因工程藥物的研發(fā)分為上游和下游兩個(gè)階段：上游階段：主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌(細(xì)胞)。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達(dá)。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)的量和分離純化的難易。 此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開(kāi)發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等。血管抑制素(angiosta

2、tin ,簡(jiǎn)稱(chēng)AGN) 是纖溶酶原的一個(gè)酶解片段,相當(dāng)于其14 Kringle 區(qū),具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制血管生成及抑制多種類(lèi)型腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的生物功能,是一種新型血管生成抑制因子1 , 2 ,對(duì)于控制腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、消化道潰瘍、關(guān)節(jié)炎等病理性血管生成具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景.PCR產(chǎn)物的T載體克?。ㄒ唬?重組T質(zhì)粒的構(gòu)建一原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶

3、和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。

4、因?yàn)镈NA片斷有兩個(gè)端點(diǎn)，所以切割時(shí)出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對(duì)于單酶切來(lái)說(shuō)，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導(dǎo)致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對(duì)載體進(jìn)行5除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3OH末端與5端，所以除磷后載體不會(huì)自環(huán)。一旦有外源片斷插入時(shí)，由外源片斷提供5端就能與載體進(jìn)行連接。通過(guò)這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。對(duì)于雙酶切來(lái)說(shuō)，無(wú)論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個(gè)特點(diǎn)是能將供體分子定向連

5、接到載體上。連接反應(yīng)的溫度在37時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16，連接12-16h（過(guò)夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。二材料與方法1 材料外源DNA片斷2 儀器、用具移液槍、碎冰3 試劑pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法連接體系如下：16連接過(guò)夜。（二） 重組質(zhì)粒

6、的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定1 材料E.coli JM109菌株2 儀器、用具超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、1.5ml 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器3 試劑(1) CaCl2、LB平板（見(jiàn)附錄）；SOC培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄）；SOB培養(yǎng)基(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；無(wú)水乙醇的Buffer W2a(3) 1電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）有毒，小心；瓊脂糖；6加樣緩沖液(4) 酚；氯仿；異戊醇(5) ddH2O；10PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；

7、M13-；TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1) 取大腸桿菌JM109保存液50l，接種于4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37，300rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，第二天取50l 轉(zhuǎn)接到新的4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3h至OD600=0.350.4，在無(wú)菌操作臺(tái)上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。(2) 4，5000rpm離心2min，去上清液。(3) 加入750l預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰浴30min。(4) 4，5000rpm離心2min，棄上清液。(5) 加入100l 冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h

8、后，4保存?zhèn)溆谩?. 重組DNA的轉(zhuǎn)化(1) 將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37預(yù)熱。(2) 于100l感受態(tài)細(xì)胞中加入10l連接產(chǎn)物，冰浴30min。(3) 將離心管轉(zhuǎn)入42水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動(dòng)離心管，迅速將其放在冰上2min。(4) 在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300l，槍頭混勻，37、150rpm溫和搖振60min。(5) 將200l 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑選白色菌落進(jìn)行鑒定。注意事項(xiàng)： 制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作，同時(shí)注意近火無(wú)菌操作，防止

9、感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。 42熱處理時(shí)很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。 菌液涂皿操作時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來(lái)回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。3 重組質(zhì)粒的鑒定方案一 菌落PCR(1) 制備PCR混合液：(2) 用經(jīng)滅菌的10l槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3) 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。(4) 將步驟 的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5) 按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94預(yù)變性3min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94變性1min，57退

10、火1min，72 延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min。(6) 取5l PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。方案二 質(zhì)粒PCR1. 堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA(1) 用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。(2) 用250l已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。(3) 加入250l Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，此步驟不宜超過(guò)5min。*Buffer S2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。(4) 加入400l Buffer

11、S3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。*若離心后凝結(jié)塊未沉淀到離心管底部，應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，12000g離心3min。(5) 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm離心1min。(6) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500l Buffer W1，5500rpm離心1min。(7) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700l已加無(wú)水乙醇的Bu

12、ffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700l已加無(wú)水乙醇的BufferW2洗滌一次。(8) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm離心1min。(9) 連濾液一并棄掉收集管，將DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 離心管中，在silica 膜中央加入25-30l Eluent或去離子水。(10) 室溫靜置2 min，14000rpm離心1min洗脫DNA。(11) 取5L樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉(zhuǎn)化子。2. 抽提純化質(zhì)粒DNA酚、氯仿抽提可以去除堿裂解法制備的質(zhì)粒DNA中殘留的蛋白質(zhì)

13、。(1) 加TE稀釋質(zhì)粒DNA溶液至300L。(2) 加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），震蕩混勻，靜置3min。(3) 14000rpm 離心5min，吸上清液，加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3min。(4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，靜置3min。(5) 14000rpm離心5min，吸上清液，加2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后-20放置15min，沉淀質(zhì)粒DNA。(6) 14000rpm離心13min，棄上清液，沉淀加入200L 70%乙醇洗滌一次，室溫干燥，用20L去離子雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA沉

14、淀，-20保存待用。(7) 取5l樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化結(jié)果。3. 質(zhì)粒PCR(1) PCR反應(yīng)體系如下：(2) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94預(yù)變性3min；然后進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94變性1min，57退火1min，72 延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min。(3) 取5l PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，方法與試驗(yàn)二相同。PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類(lèi)，平滑末端連接和粘性末端連接，平滑末端比粘性末端的連接效率要低很多。平滑末端連接：載體為平末端，可用 EcoR V或Sma I酶切，同時(shí)為了防止載體自連，對(duì)載體做了去磷酸處理。PCR產(chǎn)物為磷酸化的平末端產(chǎn)

15、物：一般高保真聚合酶擴(kuò)增得到，高保真聚合酶有很強(qiáng)的35外切酶活性?；?qū)⒎瞧侥┒说腜CR產(chǎn)物使用DNA聚合酶進(jìn)行平末端處理。對(duì)于平末端的PCR產(chǎn)物還需要進(jìn)行磷酸化處理，使其5磷酸化。粘性末端連接：1、酶切克隆：在PCR引物的5端引入與載體匹配，不同識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)酶切位點(diǎn)，載體使用同樣的限制性?xún)?nèi)切酶酶切，進(jìn)行連接，通?？梢缘玫蕉ㄏ蚩寺〉慕Y(jié)果。2、TA克隆：TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，它用PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)非模板依賴(lài)的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以

16、快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。TA克隆沒(méi)有方向性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 科技名詞定義中文名稱(chēng)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 英文名稱(chēng)：polymerase chain reaction;PCR 定義1：用引物和DNA聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增特定的DNA區(qū)域的一種技術(shù)。 所屬學(xué)科： HYPERLINK /view/71787.htm t _blank 生態(tài)學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ； HYPERLINK /view/904244.htm t _blank 分子生態(tài)學(xué)(二級(jí)學(xué)科) 定義2：體外酶促合成特異脫氧核糖核酸片段的技術(shù)。 所屬學(xué)科： 水產(chǎn)學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ；水產(chǎn)生物育種學(xué)(二級(jí)學(xué)科)

17、 定義3：通過(guò)DNA互補(bǔ)雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環(huán)來(lái)擴(kuò)增DNA特定序列的方法。 所屬學(xué)科： HYPERLINK /view/15372.htm t _blank 細(xì)胞生物學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ； HYPERLINK /view/3729641.htm t _blank 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)(二級(jí)學(xué)科) 定義4：由穆利斯(K. B. Mullis)于1988年首創(chuàng)的一種在體外模擬發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)的DNA快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的復(fù)制過(guò)程的技術(shù)。 所屬學(xué)科： HYPERLINK /view/8907.htm t _blank 遺傳學(xué)(一級(jí)學(xué)科) ； HYPERLINK /view/71778.htm

18、t _blank 分子遺傳學(xué)(二級(jí)學(xué)科) 本內(nèi)容由 HYPERLINK /view/1490464.htm t _blank 全國(guó)科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會(huì)審定公布 目錄 HYPERLINK javascript:void(0) 隱藏 HYPERLINK /view/29641.htm l 1#1 概述 HYPERLINK /view/29641.htm l 2#2 PCR原理 HYPERLINK /view/29641.htm l 3#3 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 HYPERLINK /view/29641.htm l 3_1#3_1 1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 HYPERLINK /view/2

19、9641.htm l 3_2#3_2 2、PCR引物設(shè)計(jì) HYPERLINK /view/29641.htm l 3_3#3_3 3、模板的制備 HYPERLINK /view/29641.htm l 3_4#3_4 4、PCR反應(yīng)條件的控制 HYPERLINK /view/29641.htm l 4#4 PCR步驟 HYPERLINK /view/29641.htm l 4_1#4_1 1.DNA變性 HYPERLINK /view/29641.htm l 4_2#4_2 2.退火 HYPERLINK /view/29641.htm l 4_3#4_3 3.延伸 HYPERLINK /vie

20、w/29641.htm l 5#5 PCR檢測(cè) HYPERLINK /view/29641.htm l 6#6 PCR反應(yīng)特點(diǎn) HYPERLINK /view/29641.htm l 6_1#6_1 特異性強(qiáng) HYPERLINK /view/29641.htm l 6_2#6_2 靈敏度高 HYPERLINK /view/29641.htm l 6_3#6_3 簡(jiǎn)便、快速 HYPERLINK /view/29641.htm l 6_4#6_4 對(duì)標(biāo)本的純度要求低 HYPERLINK /view/29641.htm l 7#7 PCR的循環(huán)參數(shù) HYPERLINK /view/29641.htm

21、 l 7_1#7_1 1、預(yù)變性（Initial denaturation） HYPERLINK /view/29641.htm l 7_2#7_2 2、循環(huán)中的變性步驟 HYPERLINK /view/29641.htm l 7_3#7_3 3、引物退火（Primer annealing） HYPERLINK /view/29641.htm l 7_4#7_4 4、引物延伸 HYPERLINK /view/29641.htm l 7_5#7_5 5、循環(huán)數(shù) HYPERLINK /view/29641.htm l 7_6#7_6 6、最后延伸 HYPERLINK /view/29641.htm

22、 l 8#8 PCR儀器 HYPERLINK /view/29641.htm l 9#9 PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法 HYPERLINK /view/29641.htm l 9_1#9_1 1、實(shí)驗(yàn)室布局 HYPERLINK /view/29641.htm l 9_2#9_2 2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) HYPERLINK /view/29641.htm l 9_3#9_3 （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) HYPERLINK /view/29641.htm l 9_4#9_4 （二）標(biāo)本制備區(qū) HYPERLINK /view/29641.htm l 9_5#9_5 （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū) HYPERLINK /

23、view/29641.htm l 1 概述 HYPERLINK /view/29641.htm l 2 PCR原理 HYPERLINK /view/29641.htm l 3 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 HYPERLINK /view/29641.htm l 3_1 1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 HYPERLINK /view/29641.htm l 3_2 2、PCR引物設(shè)計(jì) HYPERLINK /view/29641.htm l 3_3 3、模板的制備 HYPERLINK /view/29641.htm l 3_4 4、PCR反應(yīng)條件的控制 HYPERLINK /view/29641.htm l

24、 4 PCR步驟 HYPERLINK /view/29641.htm l 4_1 1.DNA變性 HYPERLINK /view/29641.htm l 4_2 2.退火 HYPERLINK /view/29641.htm l 4_3 3.延伸 HYPERLINK /view/29641.htm l 5 PCR檢測(cè) HYPERLINK /view/29641.htm l 6 PCR反應(yīng)特點(diǎn) HYPERLINK /view/29641.htm l 6_1 特異性強(qiáng) HYPERLINK /view/29641.htm l 6_2 靈敏度高 HYPERLINK /view/29641.htm l 6

25、_3 簡(jiǎn)便、快速 HYPERLINK /view/29641.htm l 6_4 對(duì)標(biāo)本的純度要求低 HYPERLINK /view/29641.htm l 7 PCR的循環(huán)參數(shù) HYPERLINK /view/29641.htm l 7_1 1、預(yù)變性（Initial denaturation） HYPERLINK /view/29641.htm l 7_2 2、循環(huán)中的變性步驟 HYPERLINK /view/29641.htm l 7_3 3、引物退火（Primer annealing） HYPERLINK /view/29641.htm l 7_4 4、引物延伸 HYPERLINK /

26、view/29641.htm l 7_5 5、循環(huán)數(shù) HYPERLINK /view/29641.htm l 7_6 6、最后延伸 HYPERLINK /view/29641.htm l 8 PCR儀器 HYPERLINK /view/29641.htm l 9 PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法 HYPERLINK /view/29641.htm l 9_1 1、實(shí)驗(yàn)室布局 HYPERLINK /view/29641.htm l 9_2 2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) HYPERLINK /view/29641.htm l 9_3 （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) HYPERLINK /view/29641.htm l 9_4

27、（二）標(biāo)本制備區(qū) HYPERLINK /view/29641.htm l 9_5 （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū) HYPERLINK /view/29641.htm l # 編輯本段概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱(chēng) HYPERLINK /view/2764.htm t _blank PCR，是一種 HYPERLINK /view/2461.htm t _blank 分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。 HYPERLINK /view/29676.htm t _blank DNA聚合酶（DNApolymerase

28、I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的Klenow PCR流程fragment of E. Coli則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性,因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。現(xiàn)今所使用的酶(簡(jiǎn)稱(chēng)Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類(lèi)似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類(lèi)似PC

29、R前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年 HYPERLINK /view/4024.htm t _blank 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 HYPERLINK /view/29641.

30、htm l # 編輯本段PCR原理DNA的 HYPERLINK /view/29533.htm t _blank 半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì) HYPERLINK /view/352480.htm t _blank 引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合

31、酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。 發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶-Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。 PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性

32、)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 HYPERLINK /view/29641.htm l # 編輯本段PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液10l4種dNTP混合物20

33、0l引物10100l模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水100 lPCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即: 引物(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。 引物有多種設(shè)計(jì)方法，與PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定。但基本原則相同 PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu。分別來(lái)自?xún)煞N不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但已發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇 模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，第一純度必須較

34、高，第二濃度不能太高以免抑制 緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見(jiàn)的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu) 2、PCR引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5端引物和3引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴(kuò)增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴(kuò)增片段3端的一小段DNA序列互補(bǔ)。 引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物長(zhǎng)度：15-30b

35、p，常用為20bp左右。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 端的互補(bǔ)重疊。 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。 引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子

36、、終止密碼子等。 v 引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）* vOligo6 （引物評(píng)價(jià)） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在線(xiàn)服務(wù)） 3、模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。 標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)

37、酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。 4、PCR反應(yīng)條件的控制PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L 底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U（100ul） 引物 濃度一般為0.1 0.5umol/L 反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù) 變性溫度和時(shí)間 95，30s 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 左右，一般在4555 延伸溫度和時(shí)間 72，1min/kb（10kb內(nèi)） Tm值=4(G+C) 2(A+T) 循環(huán)次數(shù) :一般為25 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始

38、濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。 HYPERLINK /view/29641.htm l # 編輯本段PCR步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步： 1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 3.延伸（70-75）：在 HYPERLINK /view/511378.htm t _blank Taq酶（在72左右，活

39、性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示： 現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60-65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。 HYPERLINK /view/29641.htm l # 編輯本段PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（ HYPERLINK /view/480156.htm t _blank 溴化乙錠， HYPERLINK /view/48988.ht

40、m t _blank EB）染色 HYPERLINK /view/36357.htm t _blank 凝膠電泳是最常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以 HYPERLINK /view/149503.htm t _blank 熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。 HYPERLINK /view/29641.htm l # 編輯本段PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合； 堿基配對(duì)原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 靶基因的

41、特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(g=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。 簡(jiǎn)便、快速PC

42、R反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。 對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。 HYPERLINK /view/29641.htm l # 編輯本段PCR的循環(huán)參數(shù)1、預(yù)變性（Initial denaturation） 模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試

43、劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。 2、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間 變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 3、引物退火（Primer annealing）退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。 退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。 4、引物延伸引物延伸一般在72進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略 延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及

44、其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。 5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。 6、最后延伸在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72維持5-15分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。 （四）PCR中的污染和假陽(yáng)性 PCR中污染主要來(lái)自 1、樣品間交叉污染； 2、先前PCR產(chǎn)物遺留（carry-over） HYPERLINK /view/29641.htm l # 編輯本段PCR儀器pcr儀器的發(fā)展 pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。自perkin elmercetus公司第一臺(tái)pcr擴(kuò)增儀問(wèn)世以來(lái)，現(xiàn)已有幾十家不同的廠(chǎng)家在國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)和銷(xiāo)售pcr擴(kuò)增儀。在短短

45、的幾年間，擴(kuò)增儀經(jīng)過(guò)幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進(jìn)一步朝方便、實(shí)用、高智能化和自動(dòng)化的方向發(fā)展。 為了便于了解和選購(gòu)適宜的pcr實(shí)驗(yàn)設(shè)備，現(xiàn)將部分國(guó)內(nèi)外pcr擴(kuò)增儀列表如下；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。國(guó)產(chǎn)1109型dna擴(kuò)增儀則是用恒溫浴機(jī)械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b體積小，智能化與自動(dòng)化程序高，可以兼做套式pcr，方便實(shí)用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動(dòng)控制溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)，可以達(dá)到節(jié)省勞動(dòng)力的目的。在采用這些儀器作pcr試驗(yàn)之前，一般均應(yīng)實(shí)測(cè)管內(nèi)溫度變化循環(huán)情況，以了解升、降溫時(shí)管內(nèi)因熱傳導(dǎo)造成的溫度滯后情況

46、和實(shí)際到達(dá)的最高、最低溫度，用于修正設(shè)計(jì)的循環(huán)參數(shù)。溫度滯后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響，這對(duì)變溫鋁塊式儀器影響更大些。對(duì)于配用制冷機(jī)式半導(dǎo)體元件致冷的儀器，在使用低于室溫的溫度來(lái)保冷pcr反應(yīng)后小管時(shí)，應(yīng)注意冷凝水的問(wèn)題，勿使流入儀器內(nèi)浸濕半導(dǎo)體元件而損壞儀器。 國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的幾種dna擴(kuò)增儀 1109型 北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合 機(jī)械臂 變溫水浴 電子調(diào)溫 400.5ml 16400元/臺(tái) 90a/b型 中科院遺傳所 機(jī)械臂 變溫水浴 電熱 14000元/臺(tái) ptc-51a/b型 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 變溫氣流 電子調(diào)兼作套式 300.5ml 12000元

47、/臺(tái) dna thermal cycler perkin elmercetus(美) 變溫鋁塊 壓縮機(jī)致冷 480.5ml us $ 20000.- thermocycler 60 00 180 b.braun biotech (德) 變溫水浴98四檔 電熱,自來(lái)水冷卻 601.5ml 1001.5ml 1801.5ml dm 30000.- automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.(美) 變溫鋁塊25100 電熱,自來(lái)水冷卻 291.5ml 581.5ml us $4985.- us $7980.-

48、grant autogen grant instrumant ltd(美) 變溫水浴099 電熱,自來(lái)水冷卻或加冷循環(huán)器 501.5ml or 501.5ml us $250. plus us $ 15.-for rack(x2) techne phc-1 phc-2 techne ltd.(英) 變溫鋁塊099三檔 電熱500w水冷100w 540.5ml 540.5ml 241.5ml 3383. 3997. - biooven biothrm corp(美) 變溫氣流 -150 115v 11a 200s of 496plate us $ 2990. - trio-thermo-bloc

49、k tb-1 biomertra(德) 半導(dǎo)體變溫 220v 320管 分別控溫 dm12900. - micro cycler e eppendorf(美) 變溫鋁塊 220v/100v 329管 us $ 3500. - PCR常見(jiàn)問(wèn)題 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 一般為48h以?xún)?nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中

50、的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重

51、引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00u

52、l，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 假陽(yáng)性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條

53、帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段

54、比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

55、適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 克隆PCR產(chǎn)物 1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？ 最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液,50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段

56、共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4過(guò)夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿(mǎn)足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4過(guò)夜。 2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。 3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？ A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。 如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。 B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化

57、效率。 例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。 鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為： 1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞 如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。 C）如用

58、pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。 D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍(lán)斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。 4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？ A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿(mǎn)足

59、大多數(shù)克隆，為提高效率，需4過(guò)夜。 B）插入片段帶有污染，使3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3-T缺失。 C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。 D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T

60、 pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。 E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于