十八章色譜法

1、十八章色譜法色譜法分類 1按兩相狀態(tài)分類 氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜GC，根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體，又可分為氣固色譜GS C和氣液色譜GLC液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜LC。同理，液相色譜亦可分為液固色譜LSC和液液色譜LLC超臨界流體為流動(dòng)相的色譜稱為超臨界流體色譜SFC。隨著色譜工作的開(kāi)展，通過(guò)化學(xué)反響將固定液鍵合到載體外表，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜CBPC。 2按別離機(jī)理分類 利用組分在吸附劑固定相上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以別離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液固定相中溶解度不同而到達(dá)別離的方法稱為分配色譜法。利用

2、組分在離子交換劑固定相上的親和力大小不同而到達(dá)別離的方法，稱為離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而到達(dá)別離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。最近，又有一種新別離技術(shù)，利用不同組分與固定相固定化分子的高專屬性親和力進(jìn)展別離的技術(shù)稱為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)的別離 3按固定相的外形分類 固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。固定相呈平板狀的色譜法，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。 根據(jù)以上所述，將色譜法的分類總結(jié)于表18-l中。18-2 色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語(yǔ)一流出曲線和色譜峰 如果進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線的線性范圍內(nèi)，色譜峰如果對(duì)稱，可用Gauss

3、正態(tài)分布函數(shù)表示： 式中：C不同時(shí)間t時(shí)某物質(zhì)的濃度，C0進(jìn)樣濃度，tr保存時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)偏差。二、基線 是柱中僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖183中Ot線穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線 三、峰高 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖183中BA 四、保存值1死時(shí)間tM 不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，如圖18 3中 OA。因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相的流動(dòng)速度相近測(cè)定流動(dòng)相平均線速時(shí)，可用往長(zhǎng)L與tM的比值計(jì)算。 2保存時(shí)間tR 試樣從進(jìn)樣開(kāi)場(chǎng)到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保存時(shí)間，如圖

4、183 OB它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間 3調(diào)整保存時(shí)間tR 某組份的保存時(shí)間扣除死時(shí)間后稱為該組份的調(diào)整保存時(shí)間，即 tR = tR-tM 由于組份在色譜柱中的保存時(shí)間tR包含了組份隨流動(dòng)相通過(guò)柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中滯留所需的時(shí)間，所以tR實(shí)際上是組份在固定相中停留的總時(shí)間保存時(shí)間可用時(shí)間單位如s或距離單位如cm表示。 保存時(shí)間是色譜法定性的根本依據(jù)，但同一組份的保存時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保存體積等參數(shù)進(jìn)展定性檢定 4死體積 VM 指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可

5、忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F0Lmin計(jì)算： VM = tMF0 5保存體積 VR 指從進(jìn)樣開(kāi)場(chǎng)到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積。保存體積與保存時(shí)間t。的關(guān)系如下： VR = tRF0 6調(diào)整保存體積VR 某組份的保存體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保存體積，即 VR = VR- VM 7相對(duì)保存值 某組份2的調(diào)整保存值與組份1的調(diào)整保存值之比，稱為相對(duì)保存值： 由于相對(duì)保存值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù) 必須注意，相對(duì)保存值絕對(duì)不是兩個(gè)組份保存時(shí)間或保存體積

6、之比 .選擇因子 在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)s，然后再求其它峰i對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保存值此時(shí)，ri/s可能大于1，也可能小于1在多元混合物分析中，通常選擇一對(duì)最難別離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保存值作為重要參數(shù)在這種特殊情況下，可用符號(hào)表示： 式中tR2為后出峰的調(diào)整保存時(shí)間，所以這時(shí)總是大于1的 。五、區(qū)域?qū)挾?色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法： 1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差 即0607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖183中EF距離的一半。 2. 半峰寬W1/2 即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如圖183中GH間的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差

7、的關(guān)系是： W1/2 3. 基線寬度W 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，如圖183中IJ的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差。的關(guān)系是： W = 4 從色譜流出曲線上，可以得到許多重要信息： l根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所合組 份的最少個(gè)數(shù) 2根據(jù)色譜峰的保存值(或位置，可以進(jìn)展定性分析 (3) 根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)展定量分析 4色譜峰的保存值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u(píng)價(jià)色譜柱別離效能的依據(jù) 5色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否適宜的依據(jù) 183 色譜法分析的根本原理 色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此別離，組分要到達(dá)完全別離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩

8、相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開(kāi)。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來(lái)研究色譜行為。 一、分配系數(shù)K和分配比k1分配系數(shù)K 如前所述，分配色譜的別離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)屢次地分配過(guò)程，而吸附色譜的別離是基于反復(fù)屢次地吸附一脫附過(guò)程。這種別離過(guò)程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來(lái)描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)見(jiàn)它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，即 2.分配比k 分配比

9、又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即 k值越大，說(shuō)明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對(duì)被別離組分保存能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。 式中CS，Cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相的濃度； Vm為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，那么表示固定相的孔體積。滯留因子Rs 分配比k值可直接

10、從色譜圖測(cè)得。設(shè)流動(dòng)相在柱內(nèi)的線速度為u，組分在柱內(nèi)線速度為us，由于固定相對(duì)組分有保存作用，所以u(píng)su此兩速度之比稱為滯留因子Rs。 Rs假設(shè)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，即 對(duì)組分和流動(dòng)相通過(guò)長(zhǎng)度為L(zhǎng)的色譜柱，其所需時(shí)間分別為整理式18-1418-17，可得 3. 分配系數(shù)K與分配比k的關(guān)系 其中稱為相比率，它是反映各種色譜柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。例如，對(duì)填充柱，其值一般為635；對(duì)毛細(xì)管柱，其值為60600。 4分配系數(shù)K及分配比k與 選擇因子的關(guān)系 根據(jù)式18-9，18-21和18-22，對(duì)A、B兩組分的選擇因子，用下式表示 式18-23說(shuō)明：通過(guò)選擇因子把實(shí)驗(yàn)測(cè)量值k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系

11、起來(lái)，對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際意義。如果兩組分的K或k值相等，那么=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說(shuō)明分不開(kāi)。兩組分的K或k值相差越大，那么別離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜別離的先決條件。 二、塔板理論 最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引人理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。 該理論假定： i在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速到達(dá)平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H。 ii以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)展的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積Vm。 iii所有組分開(kāi)場(chǎng)時(shí)存在于第0號(hào)塔板

12、上，而且試樣沿軸縱向擴(kuò)散可忽略。 iv分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。 為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，設(shè)色譜往由5塊塔板n5，n為柱子的塔板數(shù)組成，并以r表示塔板編號(hào)，r=1，2，nl；某組分的分配比k=1. 根據(jù)上述假定，在色譜別離過(guò)程中，該組分的分布可計(jì)算如下： 開(kāi)場(chǎng)時(shí)，假設(shè)有單位質(zhì)量，即m=1例1mg或1g的該組分加到第0號(hào)塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。當(dāng)一個(gè)板體積lV的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0號(hào)板時(shí)，就將氣相中含有nm局部組分的載氣頂?shù)?號(hào)板上，此時(shí)0號(hào)板液相或固相中ns局部組分及1號(hào)板氣相中的nm局部組分，將各自在兩相間重新分配。故0號(hào)板上所含組

13、分總量為05，其中氣液或氣固兩相各為025而1號(hào)板上所含總量同樣為05氣液或氣固相亦各為025。以后每當(dāng)一個(gè)新的板體積載氣以脈動(dòng)式進(jìn)入色譜柱時(shí)，上述過(guò)程就重復(fù)一次(見(jiàn)下表)。 按上述分配過(guò)程，對(duì)于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動(dòng)進(jìn)入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量氣液兩相中的總質(zhì)量見(jiàn)表：18-2由塔板理論可建流出曲線方程：m為組分質(zhì)量，Vr為保存體積，n為理論塔板數(shù)。 當(dāng)V=Vr 時(shí)，C值最大，即由流出曲線方程可推出： 而理論塔板高度H即： 從上兩式可以看出，色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。 通常填充色譜柱的n103，H1mm。而毛細(xì)管柱 n=105-106 由于死時(shí)tm包括在tr中,而實(shí)際的tm不參與柱內(nèi)分配,所計(jì)算的n值盡大,H很小,但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn).所以,提出把tm扣除,采用有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高Heff評(píng)價(jià)柱效能。 塔板理論用熱力學(xué)觀點(diǎn)