谷蛋白提取實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一 小麥亞基（HMW-GS）的提取1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庑←淗MW-GS提取及SDS原理。掌握小麥HMW-GS提取及SDS方法。2小麥HMW-GS變異類型圖1 以中國春（CS）為基準(zhǔn)的各種小麥HMW-GS的SDS譜帶及亞基的編號(hào)（a、b、c、d等）（Payne lawrence,1983）3二、實(shí)驗(yàn)原理變性劑SDS破壞蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，裂解后的氨基酸側(cè)鏈和SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束在水溶液中的形狀像一個(gè)長橢圓棒，橢圓棒的短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本是相同的，但長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。膠

2、束在SDS中的電泳遷移率主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。SDS電泳不僅可以分離蛋白質(zhì)，而且可以根據(jù)遷移率的大小測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量。圖1 蛋白質(zhì)樣品用SDS和還原劑處理后解聚成亞基4不連續(xù)電泳包括兩種不同孔徑的凝膠：濃縮膠和分離膠。濃縮膠：凝膠濃度較小，孔徑相對(duì)較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過較大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶，使樣品組分在分離膠中得以高分辨率的分離。分離膠：又稱電泳膠，通?？讖捷^小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好的分離。分離膠又可為均一膠和梯度膠。本實(shí)驗(yàn)用的是均一膠。二、實(shí)驗(yàn)原理圖2 SDS不連續(xù)電泳（分離膠為均勻膠）51

3、. 實(shí)驗(yàn)儀器 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及配套電泳槽、搖床、 臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器、 電子天平2. 實(shí)驗(yàn)試劑 樣品提取液、1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液、30% Acr-0.8% Bis溶液 、10% SDS溶液、1.5% 過硫酸銨溶液、 Tris-甘氨酸電極緩沖液、考馬斯亮蘭染色液 三、實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)試劑62. 實(shí)驗(yàn)試劑1 樣品提取母液: 6g SDS(十二烷基硫酸鈉)+37.5ml 0.5M Tris-HCl（pH6.8） +30.0mg溴酚蘭+17.4ml蒸餾水+30ml甘油2 樣品提取液: 27.2ml樣品提取母液+ 4.8ml -巰基

4、乙醇+64ml蒸餾水3 1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液:18.17g Tris 溶于40ml水中，加濃HCl調(diào)pH至8.8，定容到100ml4 0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液:6.05g Tris溶于40ml水中，加濃HCl調(diào)pH 至6.8，定容到100ml5 30% Acr(丙烯酰胺)-0.8% Bis(N, N-甲叉雙丙烯酰胺)溶液: 30gAcr+0.8gBis溶于40ml水中，定容到100ml6 10% SDS溶液:10g SDS加40ml蒸餾水溶解，定容到100ml7 1.5% 過硫酸銨（AP）溶液:0.15g AP溶于10ml蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。8 Tr

5、is-甘氨酸電極緩沖液:3.032g Tris+1g SDS+14.4g甘氨酸,定至1000ml9 考馬斯亮蘭染色液:250ml甲醇+100ml乙酸+0.6g考馬斯亮蘭+250ml蒸餾水10 脫色液:50ml甲醇+50ml乙酸+400ml蒸餾水；也可以直接用自來水作脫色液7四、實(shí)驗(yàn)步驟將小麥籽粒砸碎放入1.5ml離心管加入400ul 50%異丙醇溶液，60水浴30min，其間搖晃2次。10000rpm離心3min，棄上清液重復(fù)以上步驟2次加入100ul提取液B1（50%異丙醇+0.3%二硫代蘇糖醇），60水浴30min加入100ul提取液B2（50%異丙醇+1.4%（v/v）4-乙烯基吡啶），

6、60水浴1h，10000rpm離心10min把160ul上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并在其中加600ul丙酮，放在41.5-2h10000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入100ul樣品提取液，放置2h以上，沉淀充分溶解后即可使用。 8五 制膠與電泳（1）取一套或兩套干凈的制膠專用玻璃板，在制膠架上 固定好（2）先按照表1的比例制好分離膠，搖勻后灌到玻璃板 間，上端留2.5cm左右空間，加入蒸餾水；等待分離 膠凝結(jié)的時(shí)間里，按表2的比例制好濃縮膠預(yù)工作液 （加入前四項(xiàng)）表1 分離膠工作液的配制試劑 單板30%Acr-0.8% Bis溶液13.3ml1.5MTris-HCl（pH8.8）

7、10.0ml10% SDS0.4ml蒸餾水13.3ml1.5% AP3.0mlTEMED30l表2 濃縮膠工作液的配制試劑 雙板30% Acr-0.8% Bis溶液2.5ml0.5M Tris-HCl（pH6.8）5.0ml10% SDS200l蒸餾水11.2ml1.5% AP1.0mlTEMED20l9五 制膠與電泳（3）分離膠凝結(jié)后膠面與水面之間會(huì)出現(xiàn)清晰的界面，此 時(shí)將水倒出來，用濾紙把剩余的水吸干；在濃縮膠預(yù) 工作液中加入表2中要求的1.5% AP及TEMED，混勻后 灌進(jìn)玻璃板內(nèi)，迅速插入樣梳（4）濃縮膠凝固后將其從制膠架上取下來，拔出樣梳，用 蒸餾水水將點(diǎn)樣孔沖干凈；將膠板夾在電泳槽上，在 電泳槽的倒入電極緩沖液，上樣量為4ul（5）接通電源，每板膠穩(wěn)流12-15mA，指示劑出膠后再跑2 h，停止電泳；（6）揭開玻璃板，切下濃縮膠，將分離膠放到染色