核醫(yī)學分子核醫(yī)學

1、分子核醫(yī)學進展 1 定義：分子生物學與實驗核醫(yī)學結合。內涵：利用示蹤技術觀察體內的生化過程并與相關基因聯系起來的一門分支學科，分子識別是其重要理論基礎。研究領域：受體顯像 基因顯像 重組單抗片段、肽類放射性藥物及微型抗體。 2特點： 1）深入分子水平認識疾病，通過細胞信息傳導、基因表達、生化代謝等多個方面，在解剖學和功能癥狀出現之前發(fā)現病變信息。2）通過特定示蹤劑，將疾病與基因表達的改變聯系起來，提高疾病診治的層次。 3）當代分子生物學研究成果是其理論源泉。4）分子識別是分子核醫(yī)學的理論基石。 5）生化代謝的評價是其理論重要組成部分。3二、當前的幾個熱門研究領域（六個領域）1、受體顯像：舉例

2、a、b、c2、受體介導的放射配體治療3、放免顯像（RI I）4、放免治療（RIT）5、基因顯像和基因放射治療 原理：將放素標記的反義寡核苷酸注入受試者體內，由于體內癌基因等有過度表達，通過體內核酸分子雜交而與相應靶基因結合，以定位、定量顯示特異靶基因，從而進行基因診斷以及破壞相應致病基因而達到治療的目的。4反義寡核苷酸基因顯像劑的特點：1）分子量小4）無免疫原性2）穿透力強5）與靶結合快3）特異性高 6）靶/非靶比值高反義寡核酸的基本要求：P303基因顯像必備條件：1）胞漿中必須有足夠的mRNA基因產物標記反義探針必須與靶細胞特異選擇性結合并保持穩(wěn)定。 56、代謝顯像：主要指PET顯像原理：+

3、衰變的放素與體內靶物質作用而損失能量被吸收、轉化為二個方向相反的高能r光子。它提供了很好的空間定位信息，經計算機處理重新購成清晰的三維圖像。 6+核素特點：大部分為人體基本元素，全部為人工生產湮滅輻射可獲得三維圖像T1/2短，一次可給較大劑量，圖像清晰重復給藥，動態(tài)觀察。臨床應用舉例： 18F-萄糖研究腦功能狀況，老年癡呆時攝取18F-萄，測腦部放射性下降。 腦瘤區(qū)18F-萄。 7三、分子生物學中的示蹤技術及應用P271（一）核酸標記：標記上放射性核素的又叫探針，或叫基因探針。1、探針分類：基因組DNA探針 CDNA探針 以mRNA為模板CRNA探針 反向合成的DNA片段 人工合成寡核探針的標

4、記物分類 放素：32P 33P 35S 3H 14C 125I等非放：生物素、地高辛等。8兩類探針的比較： 放素探針非放探針靈敏度高、應用廣對人體有害、壽命短靈敏度低，對核酸分子有修飾作用，但無放射危害，壽命長六種常用的放素的性質、特點 P273 表111 92、核酸探針的具體標記方法： 體內標記：將32P磷酸鹽加到細胞或細菌培養(yǎng)體系中，使32P參入新合成的核酸分子上。 酶促法體外標記：很常用，先將核素預先標記在核苷酸上，然后利用多種核酸聚合酶將核苷酸參入到探針分子中或交換到探針分子中去。 常見的幾種外標記方法：1）DNA缺口平移法：已有試劑盒提供如Amash ema, promega, BR

5、2等公司。2）隨機引物法：也有試劑盒上市。10 兩種方法注意點：模板越小，產物的比活度越高；產物的長度與加入寡核苷酸引物的量成正比；有5種原因常引起標記礙障： a、DNA雙鏈未充分變性； b、DNA純度不佳； c、Klenow酶效價不夠； d、DNA片段太少，G50分離時丟失； e、DNA用量過大或過少。 11 3）單鏈DNA探針標記：在M13噬菌體的環(huán)狀單鏈上合成互補DNA鏈時參入放素。 4）CDNA探針標記：以mRNA為模板，在引物和四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，其中一種為標記物）存在下，經酶促聚合反應合成互補標記CDNA。 5）RNA探針標記：P275 6）DNA探針的5端標記：P2

6、75 7）DNA探針的3端標記：P276 8）PCR-DNA標記：PCR擴增時通過合成DNA將32P-dNTP參入到DNA分子中達到標記作用。 將32PdNTP參入到DNA分子中達到標記作用。123、核酸標記的檢測核酸標記方法很多，雖已大部分商品化和標準化，但環(huán)節(jié)繁雜，試劑質量及操作等影響因素多，標記完成后應定性、定量檢測。 參入核酸中的cpm主要兩個指標：參入比= -100% 加入的標記品總cpm 比活性：指每微克核酸中的放射性計數cpm/gDNA(RNA) 13 4、核酸標記注意事項：1）同位素的安全防護2）核酸原料一般用50-150ng，越少，產品比活度越高。3）標記前體32P-dNTP

7、，用時須真空抽干4）使用的Ependoff管和吸頭需先硅化、防止吸附。5）標記物應及時用，-20可保存13天6）嚴格按廠家說明書操作，最好做預實驗。7）個別標記方法標記前需做DNA變性處理。14（二）核酸分子雜交技術 定義：具有一定同源性的核酸單鏈在一定條件下按鹼基互補原則形成異源雙鏈的過程。 雜交步驟：核酸探針與核酸樣品（處理好的）混合反應漂洗ARG or測量分析。固相雜交：1）Southern印跡雜交：P277、查DNA序列，分析基因結構、并進行定性、定量研究。 步驟：提取DNA酶解DNA瓊脂糖電泳轉移硝酸纖維膜上并固定雜交ARG 2）Nothern印跡雜交法：主要查RNA序列，步驟大致同

8、上。15 3）斑點雜交：將變性的DNAorRN點樣在硝酸纖維膜上，然后雜交，ARG。 4）反向斑點雜交：將多種未標記的已知序列寡核苷酸探針點樣于纖維膜，再將待分析的DNA用放素標記后與其雜交，ARG根據雜交點判斷DNA序列。P278 5）菌落、噬菌斑原位雜交：將微生物點于纖維素膜或貼印方式轉移微生物，曝露細胞DNA，鹼化DNA變性，并固定，再進行斑點雜交過程。 6）組織、細胞原位雜交：將組織切片或細胞固定在玻片上，用已知的標記核酸探針進行雜交。 特點；不需以細胞中提取DNAorRNA，通過ARG在顯微鏡下觀察銀顆粒，進行定位、定性研究，定位準。敏感性高，對含量極低的靶序列也可檢測。 16注：如

9、原位雜交采用非放探針，可染色顯微觀察。液相雜交： 將變性的單鏈核酸與探針在溶液中自由雜交，適當方法分離獲得雜交分子、測放了解其特定序列的信息。特點： 1）受檢的目標核酸與示蹤的標記核酸均不在支持相上。 2）主要用于基因篩選和將基因組中重復的序列與單一序列分離出來。17（三）DNA序列分析 DNA序列分析的兩個基本步驟 DNA片段的制備的擴增 測定 DNA序列 PCR測序分析：利用一對高特異性引物，可以直接從基因文庫中原始克隆或從極復雜的基因組DNA中，通過不對稱PCR反應制備特定基因片段為測序模板（單鏈DNA），然后用雙脫氧法完成序列分析。 雙脫氧法 指當有雙脫氧核糖核苷三磷酸ddNTP參入時

10、，鏈的延長就終止，可以得到一系列長度不同的核酸片段，由于4種原料dNTP中有一種是標記的，所以可通過ARG，從圖上讀出被測DNA的鹼基排列序列。常用方法：未端終止法 化學法 P28018（四）重組DNA和基因工程 重組DNA基因克?。ɑ蚬こ蹋褐覆捎梅肿由飳W技術在試管內有目的地切割分離純化或人工合成的DNA分子和相應的載體，并將其拼接成重組DNA后導入合適的宿主細胞中，使之大量擴增形成克隆，并表達基因產物。 基因工程的基本步驟：P282了解 與核醫(yī)學相關技術基因診斷：核酸分子雜交技術中用的放素，主要包括遺傳性疾病、癌基因與抗癌基因的研究。 （五）聚合酶鏈反應PCR P284 了解 （六）蛋

11、白質合成中的核技術應用 P287了解19（七）半抗原標記及其應用：P215半抗原：定義不能誘導產抗體，但能反應。應用原理：將半抗原看作為放素去標記核酸或抗體，激素等分子（方法已趨成熟）。然后把能與半抗原結合的相應抗體用熒光素、酶或膠體金標記上，然后作示蹤研究，通過測熒光素或顯色反應進行定位和定性研究。20舉例： （1）地高率半抗原標記：將地高率通過一個“聯結臂”結在duTP上，再用隨機引物法或其它酶反應方法將DIGduTP摻入到核酸上，反應完后用堿性磷酸酶標記的抗DIG抗體去結合，而該酶可顯色反應。*）而膠體金即為氯化金分子呈膠體態(tài)粉紅色，具有高電子密度和能與大分子物質結合的特征，可在電鏡，光鏡下進行定性，定位研究。2）二硝基苯或三硝基苯（DNP或TNP）半抗原標記：它可標蛋白、激素、抗體等。示蹤過程酶顯色。21（八）免疫PCR技術：P216定義：PCR+Ag-Ab結合反應的新技術。原理：DNA作為標記物（看做放素），最后可用PCR將DNA擴增，通過測定DNA的量進行定性研究的一種方法?；痉磻?）將待測抗原固化試管底部2）加入生物素標記的特異抗體Ab-b3）加入親和