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1、分子核醫(yī)學(xué)進(jìn)展 1 定義:分子生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)結(jié)合。內(nèi)涵:利用示蹤技術(shù)觀察體內(nèi)的生化過(guò)程并與相關(guān)基因聯(lián)系起來(lái)的一門分支學(xué)科,分子識(shí)別是其重要理論基礎(chǔ)。研究領(lǐng)域:受體顯像 基因顯像 重組單抗片段、肽類放射性藥物及微型抗體。 2特點(diǎn): 1)深入分子水平認(rèn)識(shí)疾病,通過(guò)細(xì)胞信息傳導(dǎo)、基因表達(dá)、生化代謝等多個(gè)方面,在解剖學(xué)和功能癥狀出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)病變信息。2)通過(guò)特定示蹤劑,將疾病與基因表達(dá)的改變聯(lián)系起來(lái),提高疾病診治的層次。 3)當(dāng)代分子生物學(xué)研究成果是其理論源泉。4)分子識(shí)別是分子核醫(yī)學(xué)的理論基石。 5)生化代謝的評(píng)價(jià)是其理論重要組成部分。3二、當(dāng)前的幾個(gè)熱門研究領(lǐng)域(六個(gè)領(lǐng)域)1、受體顯像:舉例
2、a、b、c2、受體介導(dǎo)的放射配體治療3、放免顯像(RI I)4、放免治療(RIT)5、基因顯像和基因放射治療 原理:將放素標(biāo)記的反義寡核苷酸注入受試者體內(nèi),由于體內(nèi)癌基因等有過(guò)度表達(dá),通過(guò)體內(nèi)核酸分子雜交而與相應(yīng)靶基因結(jié)合,以定位、定量顯示特異靶基因,從而進(jìn)行基因診斷以及破壞相應(yīng)致病基因而達(dá)到治療的目的。4反義寡核苷酸基因顯像劑的特點(diǎn):1)分子量小4)無(wú)免疫原性2)穿透力強(qiáng)5)與靶結(jié)合快3)特異性高 6)靶/非靶比值高反義寡核酸的基本要求:P303基因顯像必備條件:1)胞漿中必須有足夠的mRNA基因產(chǎn)物標(biāo)記反義探針必須與靶細(xì)胞特異選擇性結(jié)合并保持穩(wěn)定。 56、代謝顯像:主要指PET顯像原理:+
3、衰變的放素與體內(nèi)靶物質(zhì)作用而損失能量被吸收、轉(zhuǎn)化為二個(gè)方向相反的高能r光子。它提供了很好的空間定位信息,經(jīng)計(jì)算機(jī)處理重新購(gòu)成清晰的三維圖像。 6+核素特點(diǎn):大部分為人體基本元素,全部為人工生產(chǎn)湮滅輻射可獲得三維圖像T1/2短,一次可給較大劑量,圖像清晰重復(fù)給藥,動(dòng)態(tài)觀察。臨床應(yīng)用舉例: 18F-萄糖研究腦功能狀況,老年癡呆時(shí)攝取18F-萄,測(cè)腦部放射性下降。 腦瘤區(qū)18F-萄。 7三、分子生物學(xué)中的示蹤技術(shù)及應(yīng)用P271(一)核酸標(biāo)記:標(biāo)記上放射性核素的又叫探針,或叫基因探針。1、探針?lè)诸悾夯蚪MDNA探針 CDNA探針 以mRNA為模板CRNA探針 反向合成的DNA片段 人工合成寡核探針的標(biāo)
4、記物分類 放素:32P 33P 35S 3H 14C 125I等非放:生物素、地高辛等。8兩類探針的比較: 放素探針?lè)欠盘结橃`敏度高、應(yīng)用廣對(duì)人體有害、壽命短靈敏度低,對(duì)核酸分子有修飾作用,但無(wú)放射危害,壽命長(zhǎng)六種常用的放素的性質(zhì)、特點(diǎn) P273 表111 92、核酸探針的具體標(biāo)記方法: 體內(nèi)標(biāo)記:將32P磷酸鹽加到細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)體系中,使32P參入新合成的核酸分子上。 酶促法體外標(biāo)記:很常用,先將核素預(yù)先標(biāo)記在核苷酸上,然后利用多種核酸聚合酶將核苷酸參入到探針?lè)肿又谢蚪粨Q到探針?lè)肿又腥ァ?常見的幾種外標(biāo)記方法:1)DNA缺口平移法:已有試劑盒提供如Amash ema, promega, BR
5、2等公司。2)隨機(jī)引物法:也有試劑盒上市。10 兩種方法注意點(diǎn):模板越小,產(chǎn)物的比活度越高;產(chǎn)物的長(zhǎng)度與加入寡核苷酸引物的量成正比;有5種原因常引起標(biāo)記礙障: a、DNA雙鏈未充分變性; b、DNA純度不佳; c、Klenow酶效價(jià)不夠; d、DNA片段太少,G50分離時(shí)丟失; e、DNA用量過(guò)大或過(guò)少。 11 3)單鏈DNA探針標(biāo)記:在M13噬菌體的環(huán)狀單鏈上合成互補(bǔ)DNA鏈時(shí)參入放素。 4)CDNA探針標(biāo)記:以mRNA為模板,在引物和四種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP,其中一種為標(biāo)記物)存在下,經(jīng)酶促聚合反應(yīng)合成互補(bǔ)標(biāo)記CDNA。 5)RNA探針標(biāo)記:P275 6)DNA探針的5端標(biāo)記:P2
6、75 7)DNA探針的3端標(biāo)記:P276 8)PCR-DNA標(biāo)記:PCR擴(kuò)增時(shí)通過(guò)合成DNA將32P-dNTP參入到DNA分子中達(dá)到標(biāo)記作用。 將32PdNTP參入到DNA分子中達(dá)到標(biāo)記作用。123、核酸標(biāo)記的檢測(cè)核酸標(biāo)記方法很多,雖已大部分商品化和標(biāo)準(zhǔn)化,但環(huán)節(jié)繁雜,試劑質(zhì)量及操作等影響因素多,標(biāo)記完成后應(yīng)定性、定量檢測(cè)。 參入核酸中的cpm主要兩個(gè)指標(biāo):參入比= -100% 加入的標(biāo)記品總cpm 比活性:指每微克核酸中的放射性計(jì)數(shù)cpm/gDNA(RNA) 13 4、核酸標(biāo)記注意事項(xiàng):1)同位素的安全防護(hù)2)核酸原料一般用50-150ng,越少,產(chǎn)品比活度越高。3)標(biāo)記前體32P-dNTP
7、,用時(shí)須真空抽干4)使用的Ependoff管和吸頭需先硅化、防止吸附。5)標(biāo)記物應(yīng)及時(shí)用,-20可保存13天6)嚴(yán)格按廠家說(shuō)明書操作,最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)。7)個(gè)別標(biāo)記方法標(biāo)記前需做DNA變性處理。14(二)核酸分子雜交技術(shù) 定義:具有一定同源性的核酸單鏈在一定條件下按鹼基互補(bǔ)原則形成異源雙鏈的過(guò)程。 雜交步驟:核酸探針與核酸樣品(處理好的)混合反應(yīng)漂洗ARG or測(cè)量分析。固相雜交:1)Southern印跡雜交:P277、查DNA序列,分析基因結(jié)構(gòu)、并進(jìn)行定性、定量研究。 步驟:提取DNA酶解DNA瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移硝酸纖維膜上并固定雜交ARG 2)Nothern印跡雜交法:主要查RNA序列,步驟大致同
8、上。15 3)斑點(diǎn)雜交:將變性的DNAorRN點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上,然后雜交,ARG。 4)反向斑點(diǎn)雜交:將多種未標(biāo)記的已知序列寡核苷酸探針點(diǎn)樣于纖維膜,再將待分析的DNA用放素標(biāo)記后與其雜交,ARG根據(jù)雜交點(diǎn)判斷DNA序列。P278 5)菌落、噬菌斑原位雜交:將微生物點(diǎn)于纖維素膜或貼印方式轉(zhuǎn)移微生物,曝露細(xì)胞DNA,鹼化DNA變性,并固定,再進(jìn)行斑點(diǎn)雜交過(guò)程。 6)組織、細(xì)胞原位雜交:將組織切片或細(xì)胞固定在玻片上,用已知的標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交。 特點(diǎn);不需以細(xì)胞中提取DNAorRNA,通過(guò)ARG在顯微鏡下觀察銀顆粒,進(jìn)行定位、定性研究,定位準(zhǔn)。敏感性高,對(duì)含量極低的靶序列也可檢測(cè)。 16注:如
9、原位雜交采用非放探針,可染色顯微觀察。液相雜交: 將變性的單鏈核酸與探針在溶液中自由雜交,適當(dāng)方法分離獲得雜交分子、測(cè)放了解其特定序列的信息。特點(diǎn): 1)受檢的目標(biāo)核酸與示蹤的標(biāo)記核酸均不在支持相上。 2)主要用于基因篩選和將基因組中重復(fù)的序列與單一序列分離出來(lái)。17(三)DNA序列分析 DNA序列分析的兩個(gè)基本步驟 DNA片段的制備的擴(kuò)增 測(cè)定 DNA序列 PCR測(cè)序分析:利用一對(duì)高特異性引物,可以直接從基因文庫(kù)中原始克隆或從極復(fù)雜的基因組DNA中,通過(guò)不對(duì)稱PCR反應(yīng)制備特定基因片段為測(cè)序模板(單鏈DNA),然后用雙脫氧法完成序列分析。 雙脫氧法 指當(dāng)有雙脫氧核糖核苷三磷酸ddNTP參入時(shí)
10、,鏈的延長(zhǎng)就終止,可以得到一系列長(zhǎng)度不同的核酸片段,由于4種原料dNTP中有一種是標(biāo)記的,所以可通過(guò)ARG,從圖上讀出被測(cè)DNA的鹼基排列序列。常用方法:未端終止法 化學(xué)法 P28018(四)重組DNA和基因工程 重組DNA基因克隆(基因工程):指采用分子生物學(xué)技術(shù)在試管內(nèi)有目的地切割分離純化或人工合成的DNA分子和相應(yīng)的載體,并將其拼接成重組DNA后導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中,使之大量擴(kuò)增形成克隆,并表達(dá)基因產(chǎn)物。 基因工程的基本步驟:P282了解 與核醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)基因診斷:核酸分子雜交技術(shù)中用的放素,主要包括遺傳性疾病、癌基因與抗癌基因的研究。 (五)聚合酶鏈反應(yīng)PCR P284 了解 (六)蛋
11、白質(zhì)合成中的核技術(shù)應(yīng)用 P287了解19(七)半抗原標(biāo)記及其應(yīng)用:P215半抗原:定義不能誘導(dǎo)產(chǎn)抗體,但能反應(yīng)。應(yīng)用原理:將半抗原看作為放素去標(biāo)記核酸或抗體,激素等分子(方法已趨成熟)。然后把能與半抗原結(jié)合的相應(yīng)抗體用熒光素、酶或膠體金標(biāo)記上,然后作示蹤研究,通過(guò)測(cè)熒光素或顯色反應(yīng)進(jìn)行定位和定性研究。20舉例: (1)地高率半抗原標(biāo)記:將地高率通過(guò)一個(gè)“聯(lián)結(jié)臂”結(jié)在duTP上,再用隨機(jī)引物法或其它酶反應(yīng)方法將DIGduTP摻入到核酸上,反應(yīng)完后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體去結(jié)合,而該酶可顯色反應(yīng)。*)而膠體金即為氯化金分子呈膠體態(tài)粉紅色,具有高電子密度和能與大分子物質(zhì)結(jié)合的特征,可在電鏡,光鏡下進(jìn)行定性,定位研究。2)二硝基苯或三硝基苯(DNP或TNP)半抗原標(biāo)記:它可標(biāo)蛋白、激素、抗體等。示蹤過(guò)程酶顯色。21(八)免疫PCR技術(shù):P216定義:PCR+Ag-Ab結(jié)合反應(yīng)的新技術(shù)。原理:DNA作為標(biāo)記物(看做放素),最后可用PCR將DNA擴(kuò)增,通過(guò)測(cè)定DNA的量進(jìn)行定性研究的一種方法。基本反應(yīng):1)將待測(cè)抗原固化試管底部2)加入生物素標(biāo)記的特異抗體Ab-b3)加入親和
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