核醫(yī)學(xué)分子核醫(yī)學(xué)

1、分子核醫(yī)學(xué)進(jìn)展 1 定義：分子生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)結(jié)合。內(nèi)涵：利用示蹤技術(shù)觀察體內(nèi)的生化過(guò)程并與相關(guān)基因聯(lián)系起來(lái)的一門分支學(xué)科，分子識(shí)別是其重要理論基礎(chǔ)。研究領(lǐng)域：受體顯像 基因顯像 重組單抗片段、肽類放射性藥物及微型抗體。 2特點(diǎn)： 1）深入分子水平認(rèn)識(shí)疾病，通過(guò)細(xì)胞信息傳導(dǎo)、基因表達(dá)、生化代謝等多個(gè)方面，在解剖學(xué)和功能癥狀出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)病變信息。2）通過(guò)特定示蹤劑，將疾病與基因表達(dá)的改變聯(lián)系起來(lái)，提高疾病診治的層次。 3）當(dāng)代分子生物學(xué)研究成果是其理論源泉。4）分子識(shí)別是分子核醫(yī)學(xué)的理論基石。 5）生化代謝的評(píng)價(jià)是其理論重要組成部分。3二、當(dāng)前的幾個(gè)熱門研究領(lǐng)域（六個(gè)領(lǐng)域）1、受體顯像：舉例

2、a、b、c2、受體介導(dǎo)的放射配體治療3、放免顯像（RI I）4、放免治療（RIT）5、基因顯像和基因放射治療 原理：將放素標(biāo)記的反義寡核苷酸注入受試者體內(nèi)，由于體內(nèi)癌基因等有過(guò)度表達(dá)，通過(guò)體內(nèi)核酸分子雜交而與相應(yīng)靶基因結(jié)合，以定位、定量顯示特異靶基因，從而進(jìn)行基因診斷以及破壞相應(yīng)致病基因而達(dá)到治療的目的。4反義寡核苷酸基因顯像劑的特點(diǎn)：1）分子量小4）無(wú)免疫原性2）穿透力強(qiáng)5）與靶結(jié)合快3）特異性高 6）靶/非靶比值高反義寡核酸的基本要求：P303基因顯像必備條件：1）胞漿中必須有足夠的mRNA基因產(chǎn)物標(biāo)記反義探針必須與靶細(xì)胞特異選擇性結(jié)合并保持穩(wěn)定。 56、代謝顯像：主要指PET顯像原理：+

3、衰變的放素與體內(nèi)靶物質(zhì)作用而損失能量被吸收、轉(zhuǎn)化為二個(gè)方向相反的高能r光子。它提供了很好的空間定位信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理重新購(gòu)成清晰的三維圖像。 6+核素特點(diǎn)：大部分為人體基本元素，全部為人工生產(chǎn)湮滅輻射可獲得三維圖像T1/2短，一次可給較大劑量，圖像清晰重復(fù)給藥，動(dòng)態(tài)觀察。臨床應(yīng)用舉例： 18F-萄糖研究腦功能狀況，老年癡呆時(shí)攝取18F-萄，測(cè)腦部放射性下降。 腦瘤區(qū)18F-萄。 7三、分子生物學(xué)中的示蹤技術(shù)及應(yīng)用P271（一）核酸標(biāo)記：標(biāo)記上放射性核素的又叫探針，或叫基因探針。1、探針?lè)诸悾夯蚪MDNA探針 CDNA探針 以mRNA為模板CRNA探針 反向合成的DNA片段 人工合成寡核探針的標(biāo)

4、記物分類 放素：32P 33P 35S 3H 14C 125I等非放：生物素、地高辛等。8兩類探針的比較： 放素探針?lè)欠盘结橃`敏度高、應(yīng)用廣對(duì)人體有害、壽命短靈敏度低，對(duì)核酸分子有修飾作用，但無(wú)放射危害，壽命長(zhǎng)六種常用的放素的性質(zhì)、特點(diǎn) P273 表111 92、核酸探針的具體標(biāo)記方法： 體內(nèi)標(biāo)記：將32P磷酸鹽加到細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)體系中，使32P參入新合成的核酸分子上。 酶促法體外標(biāo)記：很常用，先將核素預(yù)先標(biāo)記在核苷酸上，然后利用多種核酸聚合酶將核苷酸參入到探針?lè)肿又谢蚪粨Q到探針?lè)肿又腥ァ?常見的幾種外標(biāo)記方法：1）DNA缺口平移法：已有試劑盒提供如Amash ema, promega, BR

5、2等公司。2）隨機(jī)引物法：也有試劑盒上市。10 兩種方法注意點(diǎn)：模板越小，產(chǎn)物的比活度越高；產(chǎn)物的長(zhǎng)度與加入寡核苷酸引物的量成正比；有5種原因常引起標(biāo)記礙障： a、DNA雙鏈未充分變性； b、DNA純度不佳； c、Klenow酶效價(jià)不夠； d、DNA片段太少，G50分離時(shí)丟失； e、DNA用量過(guò)大或過(guò)少。 11 3）單鏈DNA探針標(biāo)記：在M13噬菌體的環(huán)狀單鏈上合成互補(bǔ)DNA鏈時(shí)參入放素。 4）CDNA探針標(biāo)記：以mRNA為模板，在引物和四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，其中一種為標(biāo)記物）存在下，經(jīng)酶促聚合反應(yīng)合成互補(bǔ)標(biāo)記CDNA。 5）RNA探針標(biāo)記：P275 6）DNA探針的5端標(biāo)記：P2

6、75 7）DNA探針的3端標(biāo)記：P276 8）PCR-DNA標(biāo)記：PCR擴(kuò)增時(shí)通過(guò)合成DNA將32P-dNTP參入到DNA分子中達(dá)到標(biāo)記作用。 將32PdNTP參入到DNA分子中達(dá)到標(biāo)記作用。123、核酸標(biāo)記的檢測(cè)核酸標(biāo)記方法很多，雖已大部分商品化和標(biāo)準(zhǔn)化，但環(huán)節(jié)繁雜，試劑質(zhì)量及操作等影響因素多，標(biāo)記完成后應(yīng)定性、定量檢測(cè)。 參入核酸中的cpm主要兩個(gè)指標(biāo)：參入比= -100% 加入的標(biāo)記品總cpm 比活性：指每微克核酸中的放射性計(jì)數(shù)cpm/gDNA(RNA) 13 4、核酸標(biāo)記注意事項(xiàng)：1）同位素的安全防護(hù)2）核酸原料一般用50-150ng，越少，產(chǎn)品比活度越高。3）標(biāo)記前體32P-dNTP

7、，用時(shí)須真空抽干4）使用的Ependoff管和吸頭需先硅化、防止吸附。5）標(biāo)記物應(yīng)及時(shí)用，-20可保存13天6）嚴(yán)格按廠家說(shuō)明書操作，最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)。7）個(gè)別標(biāo)記方法標(biāo)記前需做DNA變性處理。14（二）核酸分子雜交技術(shù) 定義：具有一定同源性的核酸單鏈在一定條件下按鹼基互補(bǔ)原則形成異源雙鏈的過(guò)程。 雜交步驟：核酸探針與核酸樣品（處理好的）混合反應(yīng)漂洗ARG or測(cè)量分析。固相雜交：1）Southern印跡雜交：P277、查DNA序列，分析基因結(jié)構(gòu)、并進(jìn)行定性、定量研究。 步驟：提取DNA酶解DNA瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移硝酸纖維膜上并固定雜交ARG 2）Nothern印跡雜交法：主要查RNA序列，步驟大致同

8、上。15 3）斑點(diǎn)雜交：將變性的DNAorRN點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上，然后雜交，ARG。 4）反向斑點(diǎn)雜交：將多種未標(biāo)記的已知序列寡核苷酸探針點(diǎn)樣于纖維膜，再將待分析的DNA用放素標(biāo)記后與其雜交，ARG根據(jù)雜交點(diǎn)判斷DNA序列。P278 5）菌落、噬菌斑原位雜交：將微生物點(diǎn)于纖維素膜或貼印方式轉(zhuǎn)移微生物，曝露細(xì)胞DNA，鹼化DNA變性，并固定，再進(jìn)行斑點(diǎn)雜交過(guò)程。 6）組織、細(xì)胞原位雜交：將組織切片或細(xì)胞固定在玻片上，用已知的標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交。 特點(diǎn)；不需以細(xì)胞中提取DNAorRNA，通過(guò)ARG在顯微鏡下觀察銀顆粒，進(jìn)行定位、定性研究，定位準(zhǔn)。敏感性高，對(duì)含量極低的靶序列也可檢測(cè)。 16注：如

9、原位雜交采用非放探針，可染色顯微觀察。液相雜交： 將變性的單鏈核酸與探針在溶液中自由雜交，適當(dāng)方法分離獲得雜交分子、測(cè)放了解其特定序列的信息。特點(diǎn)： 1）受檢的目標(biāo)核酸與示蹤的標(biāo)記核酸均不在支持相上。 2）主要用于基因篩選和將基因組中重復(fù)的序列與單一序列分離出來(lái)。17（三）DNA序列分析 DNA序列分析的兩個(gè)基本步驟 DNA片段的制備的擴(kuò)增 測(cè)定 DNA序列 PCR測(cè)序分析：利用一對(duì)高特異性引物，可以直接從基因文庫(kù)中原始克隆或從極復(fù)雜的基因組DNA中，通過(guò)不對(duì)稱PCR反應(yīng)制備特定基因片段為測(cè)序模板（單鏈DNA），然后用雙脫氧法完成序列分析。 雙脫氧法 指當(dāng)有雙脫氧核糖核苷三磷酸ddNTP參入時(shí)

10、，鏈的延長(zhǎng)就終止，可以得到一系列長(zhǎng)度不同的核酸片段，由于4種原料dNTP中有一種是標(biāo)記的，所以可通過(guò)ARG，從圖上讀出被測(cè)DNA的鹼基排列序列。常用方法：未端終止法 化學(xué)法 P28018（四）重組DNA和基因工程 重組DNA基因克隆（基因工程）：指采用分子生物學(xué)技術(shù)在試管內(nèi)有目的地切割分離純化或人工合成的DNA分子和相應(yīng)的載體，并將其拼接成重組DNA后導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，使之大量擴(kuò)增形成克隆，并表達(dá)基因產(chǎn)物。 基因工程的基本步驟：P282了解 與核醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)基因診斷：核酸分子雜交技術(shù)中用的放素，主要包括遺傳性疾病、癌基因與抗癌基因的研究。 （五）聚合酶鏈反應(yīng)PCR P284 了解 （六）蛋

11、白質(zhì)合成中的核技術(shù)應(yīng)用 P287了解19（七）半抗原標(biāo)記及其應(yīng)用：P215半抗原：定義不能誘導(dǎo)產(chǎn)抗體，但能反應(yīng)。應(yīng)用原理：將半抗原看作為放素去標(biāo)記核酸或抗體，激素等分子（方法已趨成熟）。然后把能與半抗原結(jié)合的相應(yīng)抗體用熒光素、酶或膠體金標(biāo)記上，然后作示蹤研究，通過(guò)測(cè)熒光素或顯色反應(yīng)進(jìn)行定位和定性研究。20舉例： （1）地高率半抗原標(biāo)記：將地高率通過(guò)一個(gè)“聯(lián)結(jié)臂”結(jié)在duTP上，再用隨機(jī)引物法或其它酶反應(yīng)方法將DIGduTP摻入到核酸上，反應(yīng)完后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體去結(jié)合，而該酶可顯色反應(yīng)。*）而膠體金即為氯化金分子呈膠體態(tài)粉紅色，具有高電子密度和能與大分子物質(zhì)結(jié)合的特征，可在電鏡，光鏡下進(jìn)行定性，定位研究。2）二硝基苯或三硝基苯（DNP或TNP）半抗原標(biāo)記：它可標(biāo)蛋白、激素、抗體等。示蹤過(guò)程酶顯色。21（八）免疫PCR技術(shù)：P216定義：PCR+Ag-Ab結(jié)合反應(yīng)的新技術(shù)。原理：DNA作為標(biāo)記物（看做放素），最后可用PCR將DNA擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)定DNA的量進(jìn)行定性研究的一種方法。基本反應(yīng)：1）將待測(cè)抗原固化試管底部2）加入生物素標(biāo)記的特異抗體Ab-b3）加入親和