質(zhì)粒提取的原理與常見問題

1、Word文檔 質(zhì)粒提取的原理與常見問題現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為猛烈，適用于較小的質(zhì)粒（15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（15Kb）。 堿裂解法是一種廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA，染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒為共價(jià)閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可以恢復(fù)其自然構(gòu)象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心

2、可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA仍在上清中。 質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。(Ve

3、ctor)(DNA) 目前，已發(fā)覺有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(簡(jiǎn)稱cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%3%。依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對(duì)分子質(zhì)量是40106以上，較小一類的相對(duì)分子質(zhì)量是10106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要打算于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。根據(jù)復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有12個(gè)質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍舊能連續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有

4、20個(gè)左右質(zhì)粒。這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛掌握之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，假如用肯定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。 質(zhì)粒提取原理 現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為猛烈，適用于較小的質(zhì)粒（15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（15Kb）。 堿裂解法是一種廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA，染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒為共價(jià)閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)

5、至中性后即可以恢復(fù)其自然構(gòu)象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA仍在上清中。 質(zhì)粒提取常見問題分析 1、影響質(zhì)粒提取的因素有哪些？ 質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與許多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培育條件、細(xì)菌細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附膜的吸附力量、提取操作的嫻熟程度等等。 2、為什么從革蘭氏陽性菌中提取質(zhì)粒要在懸浮液中加入溶菌酶？ 革蘭氏陽性菌有一層細(xì)胞壁，必需加入溶菌酶才能使之溶解。 3、如何依據(jù)試驗(yàn)需要選擇不同級(jí)別的產(chǎn)品？ 從純度上：各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、測(cè)序、文庫篩選、連接和轉(zhuǎn)化，一般純度的質(zhì)?？梢詽M意要求；而對(duì)于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，則要求使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒方能滿意要求。 從提取的量上：1-20g，應(yīng)選擇小量提取試劑盒；20-