高通量測序技術(shù)的臨床應(yīng)用

1、2018-5-14基因組學(xué)的發(fā)展歷程1900年：Mendel遺傳學(xué)的重新發(fā)現(xiàn)（ 分離和自由組合定律 ）1910年：Morgan連鎖遺傳學(xué)（連鎖與互換定律）1944年：Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)揭示 DNA可能是遺傳物質(zhì)1953年：DNA雙股螺旋的發(fā)現(xiàn)高通量測序技術(shù)臨床應(yīng)用1963年：放射免疫測定技術(shù)（ 放射性核素標(biāo)記）19721977 年：重組DNA技術(shù)、核酸測序方法1983年：PCR測定技術(shù)1990年：人類基因組計(jì)劃啟動1995年：第一個原核生物（細(xì)菌）基因組測序完成1996年：第一個真核生物（酵母）基因組測序完成1998年：第一個多細(xì)胞生物（ 線蟲）基因組測序完成2000年：果蠅和擬南芥

2、的基因組測序完成。人類和水稻基因組序列第一張草圖完成2003年：人類基因組計(jì)劃基本完成 。后基因組的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究，藥物基因組學(xué)2007年- 新一代高通量測序技術(shù)李金明 國家衛(wèi)生健康委員會臨床臨床檢驗(yàn)中心2018.05.03 山東基因擴(kuò)增培訓(xùn)班基本概念藥物基因組學(xué)（Pharmacogenomics ） 基因組（genome）：由gene與choromosome 兩詞組合而成，意為 染色體上的全部基因。包含了某一生物所具有的一套完整的遺傳信息或整套染色體組（一倍體或單倍體）。藥物基因組學(xué)（Pharmacogenomics ）:又稱基因組藥物學(xué)或基因組藥理學(xué)，是藥理學(xué)或基因組學(xué)的一

3、個分支。它是研究 基因組或基因變異對藥物在人體內(nèi)吸收、代謝、療效及不良反應(yīng)產(chǎn)生影響的現(xiàn)象及其機(jī)制從而指導(dǎo)新藥開發(fā)和合理用藥。 基因組學(xué)（genomics ）：1986年由Thomas Roderick 首創(chuàng)，用于概括涉及 基因組作圖、測序和整個基因組功能分析 的遺傳學(xué)分支學(xué)科。并用其命名了一個新的雜志Genomics 。， 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics ）：以全基因組測序?yàn)槟繕?biāo)的基因結(jié)構(gòu)研究，弄清整個基因組中全部基因的 位置和結(jié)構(gòu)。對研究蛋白質(zhì)化學(xué)的專家而言，“結(jié)構(gòu)基因組學(xué)”意味著決定一種生物的所有 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) 。基因組CYP2D6基因變異（SNP） 功能基因組學(xué)

4、（functional genomics ）：利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究提供的信息，以高通量、大規(guī)模實(shí)驗(yàn)方法及統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)分析為特征，全面系統(tǒng) 分析全部基因的功能，包括生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)和發(fā)育學(xué)等功能。CYP3A4/5藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物靶點(diǎn)藥代動力學(xué)藥效動力學(xué)CYP2D6CYP3A4/5藥物療效和毒性的個體差異生命是數(shù)字的?。?Life is digital! ）-楊煥明（基因組學(xué) ，2017 科學(xué)出版社）生物信息學(xué)（bioinformatics ）基因測序技術(shù)的發(fā)展生命是序列的?。↙ife is of sequence! ）- 楊煥明（基因組學(xué) ，2017 科學(xué)出版社）1965年：酵母tRNA測

5、序（美國Comell大學(xué)Rober Holley ，小片段重疊法） 研究生物信息的采集、處理、存儲、傳播，分析和解釋等各方面的學(xué)科，也是由 生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展相結(jié)合形成的一門新學(xué)科。它通過綜合利用生物學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)而揭示大量而復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)所賦有的生物學(xué)奧秘 。1971年：噬菌體兩個粘性末端的完整序列 （吳瑞博士，華裔分子生物學(xué)專家，引物延伸測序）1975年：加減法 DNA測序（英國劍橋大學(xué)Fred ）1977年：Sanger測序（英國劍橋大學(xué)Fred Sanger ）和Maxam-Gillbert DNA 化學(xué)降解法測序(美國哈佛AlanMaxam &Walter Gilb

6、ert ） 其核心內(nèi)容是，研究如何 通過對DNA序列的統(tǒng)計(jì)計(jì)算分析，更加深入地理解DNA序列、結(jié)構(gòu)、演化及其與生物功能之間的關(guān)系，涉及到分子生物學(xué)，分子演化及結(jié)構(gòu)生物學(xué)，統(tǒng)計(jì)學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)等許多領(lǐng)域。1980年代：采用Sanger測序原理的自動化測序儀1996年：焦磷酸測序（瑞典皇家技術(shù)研究所Ronaghi M 等） 其核心是基因組信息學(xué)，包括基因組信息的獲取，處理，存儲，分配和解釋 ?；蚪M信息學(xué)的關(guān)鍵是讀懂基因組的核苷酸順序，即全部基因在染色體上的確切位置 以及各DNA片段的功能；同時在發(fā)現(xiàn)了新基因信息之后進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測 ，然后依據(jù)特定蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)。2005年:G

7、enome Sequencer20 新一代測序儀(大規(guī)模并行焦磷酸合成測序法 ，454 life Science 公司的創(chuàng)始人JonathanRothberg)2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD測序儀）公司分別被Roche、illumina和ABI公司收購。新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing ）2007年被Nature Methods 評為生物領(lǐng)域影響力最大的技術(shù) 了解基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理也是生物信息學(xué)的重要內(nèi)容，根據(jù)生物分子在基因調(diào)控中的作用，描述人類疾病的診斷，治療內(nèi)在規(guī)律。它的研究目標(biāo)是揭示 基因組信息結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語

8、言的根本規(guī)律，解釋生命的遺傳語言。12018-5-14分子檢測基本方法新一代高通量測序技術(shù) 實(shí)時熒光PCR方法（擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)法（Amplification Refractory Mutation System ，ARMS）、PCR-高分辨溶點(diǎn)曲線分析（ HRM）、數(shù)字PCR等）公司名稱技術(shù)原理技術(shù)開發(fā)者一些其他基因擴(kuò)增檢驗(yàn)方法 ：TMA、NASBA 、LAMP、LCR等。Apply Biosystems(ABI)基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接 DNA測序法美國Agencourt 私人基因組學(xué)公司（ APG）PCR-雜交法（膜上、芯片基因芯片 、乳膠顆粒Luminex）IlluminaRoch

9、e合成測序法英國Solexa公司首席科學(xué)家David BentleyPCR-Sanger測序PCR-焦磷酸測序非擴(kuò)增的信號放大 ：bDNA大規(guī)模并行焦磷酸合成測序法美國454 Life Sciences 公司的創(chuàng)始人Jonathan Rothberg美國斯坦福大學(xué)生物工程學(xué)家 Stephen QuakePCR-新一代高通量測序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等Helicos大規(guī)模并行單分子合成測序法 熒光原位雜交 直接雜交Complete GenomicsDNA納米陣列與組合探針錨定連接測序法美國Complete Genomics 公司首席科學(xué)家radoje drmanacIllumin

10、a測序原理ION 系列測序原理該技術(shù)使用一種高密度半導(dǎo)體芯片，表面布滿獨(dú)立的小孔作為測序反應(yīng)池進(jìn)行聚合反應(yīng)， 當(dāng)核苷酸配對到模板鏈上時會釋放出一個氫離子，導(dǎo)致反應(yīng)池中 pH 的改變。反應(yīng)池下方有感應(yīng)器可感應(yīng)氫離子信號，從而識別出DNA 序列。illumina的核心原理為邊合成邊測序，主要有4 個步驟：u1） DNA 文庫構(gòu)建：利用超聲波將待測 DNA 鏈碎片化為200-500 堿基長的片段，并在片段兩頭 加上接頭引物。uuu2） Flowcell 吸附：文庫構(gòu)建好后，將文庫 DNA 通過flowcell 的表面槽道，槽道里有很多接頭，可與 DNA 碎片兩端的接頭相互配對，因此 DNA 碎片會被

11、吸附在flowcell 的表面。3） 橋式PCR 擴(kuò)增：目的在于將堿基信號強(qiáng)度放大，以達(dá)到測序需要的信號要求。橋式PCR 以槽道上的接頭為模板進(jìn)行擴(kuò)增，最終每個 DNA 片段都在各自的位置上集中成束，每一束含有多個 DNA 模板片段的拷貝。ION 技術(shù)和454 技術(shù)同由Jonathan Rothberg 發(fā)明，因此在DNA 碎片化和PCR 擴(kuò)增步驟的原理與454 非常相似，區(qū)別在于測序并非焦磷酸法而是通過檢測氫離子信號來識別堿基序列。 ION 的特點(diǎn)在于成本較低，操作也比較簡單，但是通量較低。4） 邊合成邊測序：反應(yīng)體系中包含 DNA 聚合酶，接頭引物和帶有特異熒光標(biāo)記的4 種dNTP，這些d

12、NTP3 端經(jīng)過化學(xué)保護(hù)，每次只能添加一個dNTP。隨后洗脫反應(yīng)，加入激發(fā)熒光所需的試劑并用激光進(jìn)行激發(fā)，采樣熒光信號分析后識別堿基，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并出去 dNTP3 端的保護(hù)，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。Life 在2010 年收購Ion Torrent ，Ion 第一個產(chǎn)品為Personal GenomeMachine（PGM），是繼Roche GS Junior 后推出的第二個精巧型測序儀，該產(chǎn)品兼容用戶的三種不同通量需求， Life 2010年推出IONProton（一代芯片PI），通量比PGM 要高，應(yīng)用范圍也更廣泛。Illumina 這種一次只添加一個dNTP 的測序原理使其能夠很

13、好解決同個堿基聚合導(dǎo)致測序不準(zhǔn)的問題（如： DNA 鏈中含有AAAAAA 這種重復(fù)性序列時，大部分測序平臺都易出現(xiàn)多讀或少讀一個堿基的錯誤）。目前Illumina 測序的錯誤率在1%以下，主要錯誤來源是 堿基的替換。WeNGS的一般流程CG測序原理（DNA納米陣列與組合探針錨定連接測序法）t生物信息學(xué)分bench患者標(biāo)本處理對序 測列析序re得ad到s 使的短用各（種算D法ry對一線BGISEQ-500 采用優(yōu)化的聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù) （cPAS）和改進(jìn)的DNA納米球（DNB）核心測序技術(shù)。b性e參n比c h人）類基因核酸提取片段化核苷酸位點(diǎn)變異識別具體而言，首先DNA分子錨和熒光探針在納米球

14、上進(jìn)行聚合，隨后高分辨率成像系統(tǒng)對光信號進(jìn)行采集，光信號經(jīng)過數(shù)字化處理后即可獲得待測序列。其中， DNB通過線性擴(kuò)增增強(qiáng)信號，降低單拷貝的錯誤率。而且， DNB大小與芯片上活性位點(diǎn)的大小相匹配，每個位點(diǎn)結(jié)合一個 DNA納米球，在保證測序精度的情況下提高了測序芯片的利用效率。采用先進(jìn)的半導(dǎo)體精密加工工藝，在硅片表面形成結(jié)合位點(diǎn)陣列，實(shí)現(xiàn)DNA納米球的規(guī)則排列吸附。變異的臨床相關(guān)分析患者樣本條碼化（分子標(biāo)簽）變異注釋外顯子或基因盤靶基因富集結(jié)果報(bào)告及解釋接頭連接文庫制備流動池裝載序列reads產(chǎn)生22018-5-14我國已開展的與測序密切相關(guān) “精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”研究大規(guī)模人群隊(duì)列研究百萬級自然人群國家大

15、型健康隊(duì)列研究重大疾病專病隊(duì)列研究中國人群參比數(shù)據(jù)庫建設(shè)與系統(tǒng)分析精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)不等于高通量測序2016 年2017 年2016 年2017 年2017 年大型自然人群隊(duì)列示范華東區(qū)域心血管疾病免疫系統(tǒng)疾病中國人群多組學(xué)參比數(shù)據(jù)與分析系統(tǒng)建設(shè)京津冀區(qū)域華中區(qū)域華南區(qū)域西北區(qū)域西南區(qū)域東北區(qū)域腦血管疾病呼吸系統(tǒng)疾病代謝性疾病乳腺癌神經(jīng)系統(tǒng)疾病精神心理疾病肺癌高通量測序是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)目前最為重要的支撐技術(shù)！前列腺癌食管癌肝癌/肝病罕見病結(jié)直腸癌胃癌高通量測序技術(shù)的臨床應(yīng)用 染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前篩查 （NIPS） 胚胎植入前遺傳學(xué)篩查 （Preimplantation Genetic Screening ，

16、PGS）和胚胎植入前基因診斷（Preimplantation Genetic Dignosis ，PGD）NGS與染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前篩查 腫瘤靶向治療基因突變檢測 單基因遺傳病檢測 病原微生物檢測：如HPV基因分型、宏基因組（ Metagenomics ）測序案例：染色體非整倍體高通量測序（ NIPS）案例：染色體非整倍體高通量測序（ NIPS）案例: 某醫(yī)院開展了染色體非整倍體的 NIPS高通量測序檢測，孕婦檢測結(jié)果為 T21陽性，醫(yī)生及孕婦（含家屬）找到實(shí)驗(yàn)室，說 孕婦已懷孕32周，如果進(jìn)行產(chǎn)前診斷（羊水檢查），等結(jié)果出來，如果是真的T21，就不能引產(chǎn)；如果根據(jù)現(xiàn)在結(jié)果引產(chǎn)，引下來，不

17、是T21又怎么辦?案例: 某同行說，現(xiàn)在醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心有這樣一個趨勢，向獨(dú)立醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所送染色體非整倍體的NIPS高通量測序檢測孕婦標(biāo)本，一些臨床醫(yī)生要求，除了要報(bào)T21、T18和T13外，還希望報(bào)性染色體、微重復(fù)、微缺失等結(jié)果，哪個公司報(bào)的越多，哪個公司的能力越強(qiáng)?32018-5-14案例3：染色體非整倍體高通量測序（ NIPS）發(fā)展歷程1997年2003年2007年數(shù)字PCR2008年2008年10月和12月案例3: 某同行說，他們醫(yī)院一個孕婦經(jīng)產(chǎn)前診斷中心做了一個染色體非整倍體的 NIPS高通量測序檢測，拿到的結(jié)果是 “低風(fēng)險 ”，孕婦就問臨床醫(yī)生，“大夫，我這個結(jié)果是 “低風(fēng)險 ”，那

18、到底有多大風(fēng)險?將醫(yī)生一下子問住了，最后這個醫(yī)生說了這樣一句話： “反正是有風(fēng)險”！在孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)cffDNARNA-SNP 等位基因比例分析和表觀遺傳學(xué)等位基因比例分析高通量測序MPS檢測首次報(bào)道2012年2013年2014年2015年高通量測序SNP法ACMG等指南發(fā)布，強(qiáng)調(diào)僅在高風(fēng)險人群使用新英格蘭雜志發(fā)表較全面ACOG，ACMG發(fā)布指南的所有人群NIPT檢測對，指出任何人群均可選擇無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測，前提是被告知檢測局限性等。比標(biāo)準(zhǔn)篩查的臨床研究大量高通量測序檢測非整倍體的臨床研究，主要為高風(fēng)險人群 陽性預(yù)測值顯著高于傳統(tǒng)篩查方案； 高風(fēng)險人群陽性預(yù)測值高于低風(fēng)險人群2016年7月2

19、8日美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG ）最新的一份聲明表示，只要不是顯著肥胖，從9-10周妊娠開始，檢測細(xì)胞游離DNA（cfDNA）的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（NIPS）適用于所有年齡段孕婦 ，以及整個妊娠期的檢測， 能夠取代常規(guī)的21、18和13三體綜合征篩查。42018-5-14NIPS結(jié)果應(yīng)如何報(bào)告?ACMG指南Obstet Gynecol. 2015 Jun 29. Epubahead of print結(jié)果報(bào)告有些實(shí)驗(yàn)室用 “陽性”或“陰性”，而有些則報(bào)告非整倍體的機(jī)會，最常用2016.7.28 美國醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)及基因 組學(xué)會（ACMG ） NIPTNIPS是目前篩查T21、T18、T13最

20、敏感的技術(shù)，篩查試驗(yàn) NIPT陽性患者必須要做產(chǎn)前診斷驗(yàn)證和專業(yè)的遺傳專家指導(dǎo)。“99%”表示高風(fēng)險，“ 4 bp)covering 143 geneswere detected.CNVs92.50%100%4 copiesuuA secondary goal for the trial is to determine the percentage of patients whose disease does not worsen for atleast six months . This is known as progression-free survival .（PFS）Gene fus

21、ions97.67%99.99%N/AIn addition to assessing the objective response rate and progression-free survival, researchers will alsodetermine time to progression (TTP) of the cancer and evaluate the side effects of the treatments. performance verificationresults by MDCombinedoverall96.98%99.99%N/AAnderson C

22、ancerCenter/about-cancer/treatment/clinical-trials/nci-supported/nci-matchJ Mol Diagn. 2017;19(2):313-327.basket trial and umbrella trial2014 VersionTargeted Agents for Patients with Other Genetic Alterations Basket trials （籃子試驗(yàn)） are designed to test the effect of a single drugon a single mutation i

23、n a variety of cancer types. （treating the differentcancer with same drugs 異癌同治） Umbrella trials （傘試驗(yàn)） are designed to test the impact of differentdrugs on different mutations in a single cancer type. （treating the samecancer with different drugs 同癌異治）2015 Version2015 Version轉(zhuǎn)移灶的系統(tǒng)治療組織學(xué)亞型檢測結(jié)果一線治療雙藥聯(lián)

24、合化療（ 1類）或抗血管生成藥物+化療Emerging Targeted Agents for Patients with Other Genetic AlterationsEGFR突變和ALK均為陰性或未知lEGFR突變檢測（1類）厄洛替尼(1類)或阿法替尼（1類）一線治療前l(fā)ll腺癌大細(xì)胞癌NSCLC NOS發(fā)現(xiàn)EGFR突變檢測EGFR突變陽性中斷或完成現(xiàn)有化療后開始厄洛替尼或阿法替尼治療或現(xiàn)有化療聯(lián)合厄洛替尼或阿法替尼llALK（1類）有足夠的樣本來確定組織學(xué)亞型（如有需要可考慮重復(fù)取材）戒煙咨詢化療期間發(fā)現(xiàn)EGFR突變轉(zhuǎn)移灶EGFRALK應(yīng)（2B類）該作為多基因檢測/二代測序的一部分c

25、c一線治療前發(fā)現(xiàn)ALK重排集成姑息治療克唑替尼(1類)ALK陽性化療期間發(fā)現(xiàn)ALK重排中斷或完成現(xiàn)有化療后開始克唑替尼治療ll考慮EGFR 突變和 ALK檢測特別是從不吸煙患者或小活檢或混合樣本EGFR ALK 應(yīng)該作為多基因檢測/二代測序的一部分 ccEGFR突變陽性腺癌、大細(xì)胞癌、NSCLC NOSl鱗狀細(xì)胞癌ALK陽性腺癌、大細(xì)胞癌、EGFR突變和ALK均為陰性或未知雙藥聯(lián)合化療（ 1類）支持治療82018-5-142016Version2016 Version2016Version2016Version2016年開始，NCCN指南對于ALK融合陽性的患者治療中新增羅氏 Alectini

26、b（艾樂替尼、阿雷替尼）2016年起，新增Osimertinib（AZD9291）用于治療攜帶EGFR T790M 突變患者2017 Version2017 Version92018-5-142018 Version日本ARIAD的Brigatinib（AP26113）（布吉他濱） 和諾華的Ceritinib（色瑞替尼）ROCHE旗下的基因泰克（Genentech. Inc ）的atezolizumab （阿特朱單抗，針對PD-L1）分子檢測的伴隨診斷（ companion diagnostics）概念 A companion diagnostic is a medical device ,

27、often an in vitro device , whichprovides information that is essential for the safe and effective use of acorresponding drug or biological product . The test helps a health careprofessional determine whether a particular therapeutic product s benefits topatients will outweigh any potential serious s

28、ide effects or risks. Companion diagnostics can:u identify patients who are most likely to benefit from a particular therapeuticproduct;u identify patients likely to be at increased risk for serious side effects as a resultof treatment with a particular therapeutic product; oru monitor response to t

29、reatment with a particular therapeutic product for thepurpose of adjusting treatment to achieve improved safety or effectiveness.u If the diagnostic test is inaccurate , then the treatment decision based on that testmay not be optimal ./MedicalDevices/./InVitroDiagnostics/ucm407297.htm日新月異日新月異 2016年

30、12月19日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)FoundationFocus TM CDx BRCA為第一個基于二代測序的伴隨診斷試劑盒 ，用于鑒定攜帶BRCA突變的晚期卵巢癌患者 ，并指導(dǎo)Clovis Oncology 公司生產(chǎn)的聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑Rubraca(rucaparib) 的用藥，后者適用于已經(jīng)用兩種或更多種化療治療并且攜帶有害的BRCA1和BRCA2基因突變（胚系遺傳或體細(xì)胞突變獲得的 ）的晚期卵巢癌患者。 在Foundation Medicine, Inc 實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，用于 FFPE樣本檢測。 2017年5月27日，美國FDA批準(zhǔn)擴(kuò)大諾華Zykadia（ceritinib 賽

31、立替尼）用于ALK+轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌（ NSCLC）患者治療。 2017年6月22日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了基于Thermo Fisher 的ion torrent ampliseq 技術(shù)，采用PGM DX 系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司 Oncomine DX Target Test （可同時檢測23個基因）中的BRAF、ROS1和EGFR突變二代基因測序檢測，作為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）治療中阿斯利康的EGFR抑制劑易瑞沙（吉非替尼） 、輝瑞的ALK和ROS1抑制劑Xalkori（crizotinib ），以及諾華公司MEK抑制劑Mekinist曲美替尼（trametinib ）和抑制劑Tafinla

32、r（dabrafenib ）這4種藥物的伴隨診斷試劑盒，在美國3個CLIA實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用。這是 FDA批準(zhǔn)的第一個可篩查多個標(biāo)志物的腫瘤二代基因測序檢測 。用于FFPE樣本檢測。 2017年5月23日，美國FDA批準(zhǔn)默沙東的Keytruda （PD-1/PD-L1 單抗）用于治療成人及兒童的不可切除的或轉(zhuǎn)移性的、 微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatelliteinstability-high ，MSI-H）的或錯配修復(fù)缺陷（mismatch repairdeficient，dMMR）的實(shí)體瘤患者（ 15腫瘤）。102018-5-14日新月異日新月異 2017年6月29日，美FDA批準(zhǔn)Illumi

33、na 與Amgen公司合作開發(fā)的 Extended RASPanel（檢測KRAS基因和NRAS基因56個變異），以確定患者能否受益于 Amgen公司的抗癌藥物 Vectibix（panitumumab 帕尼單抗）。Vectibix于2006年9月首次獲FDA批準(zhǔn)，作為一種單藥療法，可用于 野生型KRAS和NRAS基因的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者 。 2017年11月30日，美國FDA宣布已批準(zhǔn)Foundation Medicine 公司針對多種實(shí)體瘤的下一代測序體外診斷（ IVD）檢測產(chǎn)品FoundationOne CDx（F1CDx）。F1CDx的檢測適用范圍更加廣泛，可檢測 324個基因中的遺

34、傳變異，并可以在任何類型的實(shí)體瘤中獲取兩種基因組特征，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和腫瘤突變負(fù)荷（TMB），進(jìn)而幫助臨床醫(yī)生進(jìn)行臨床管理。此外，對于五種類型的腫瘤，包括 非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌，這款產(chǎn)品測試可以用作伴隨診斷，以判斷哪些患者可能受益于 FDA批準(zhǔn)的癌癥靶向療法。 2017年11月15日，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥研究中心 （Memorial SloanKettering Cancer Center ，簡稱MSK）基于二代測序技術(shù)的癌癥基因檢測分析平臺MSK-IMPACT 。MSK-IMPACT 是一種基于高通測序檢測原理，用于檢測福爾馬林固定的石蠟

35、包埋的腫瘤組織（ FFPE）樣本中468種基因突變及遺傳變異 。樣本來源于實(shí)體瘤患者人群，可檢測包含 點(diǎn)突變，小插入和缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 。該產(chǎn)品作為一種腫瘤靶標(biāo)的綜合突變分析產(chǎn)品，明確 不用于伴隨診斷用途 ，僅供紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥研究中心有資質(zhì)的專業(yè)人員根據(jù)專業(yè)指南進(jìn)行使用。液體活檢（liquid-based biopsy ） A liquid-based biopsy ，is the blood sample which can provide geneticlandscape of all cancerous lesions （primary and metastases ）as we

36、ll asthe opportunity to systematically track genomic evolution, sach ascirculating tumor cell （CTC）and circulating tumor DNA （ctDNA） 譯：即能提供所有腫瘤來源（原發(fā)和轉(zhuǎn)移）的遺傳信息 以及全面追蹤基因組進(jìn)化機(jī)會的血液標(biāo)本，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）和循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）JClin Oncol 32:579-586. 2014早期檢測、腫瘤疾病整體的分子不均一性評估 、腫瘤發(fā)展動態(tài)評估、靶向治療基因檢測、早期治療應(yīng)答評估、腫瘤微小殘留監(jiān)測、耐藥變化的實(shí)時評估C

37、rowley, E. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472484 (2013)已知病原微生物的高通量檢測HPV、HBV、HCV分型NGS與微生物檢測112018-5-14宏基因組學(xué) - 高通量測序的意義高通量測序技術(shù)臨床應(yīng)用的質(zhì)量管理 國家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)政醫(yī)管局高通量測序臨床應(yīng)用試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室： 評審不明或未知病原感染的檢測標(biāo)準(zhǔn)、評審、試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基本要求 、管理試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室體表體內(nèi)微生物：腸道等微生態(tài)的意義 2015年增加質(zhì)評調(diào)查：全國腫瘤診斷與治療高通量測序檢測 2016年新增質(zhì)評計(jì)劃：染色體非整倍體（21、13、18）無創(chuàng)產(chǎn)篩 2016年增加質(zhì)評調(diào)查：腫瘤游離

38、DNA（ctDNA）檢測 2017年新增質(zhì)評調(diào)查：全國腫瘤診斷與治療高通量測序檢測全國腫瘤靶向測序生物信息學(xué)分析高通量測序?qū)嶒?yàn)室設(shè)計(jì)的基本流程N(yùn)GS實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室物理分區(qū)及空氣流向控制明確擬采用的測序平臺和檢測技術(shù)流程（濕桌和干桌過程）明確NGS檢測項(xiàng)目種類和預(yù)計(jì)的近期、中期和遠(yuǎn)期日常工作量明確臨床應(yīng)用目的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)（同時考慮實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件及輔助設(shè)施）及選址選擇施工建設(shè)單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室建設(shè)無創(chuàng)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（ Illumina平臺）無創(chuàng)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（ Illumina平臺）測序區(qū)空氣流向文庫擴(kuò)增與檢測區(qū)標(biāo)本與文庫制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間

39、專用走廊NIPS檢測實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)（ Illumina平臺示例，工作量較大，二區(qū)使用2次/天）NIPS檢測實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)（ Illumina平臺示例，工作量較小，二區(qū)使用 1次/天）122018-5-14無創(chuàng)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（ Ion Torrent平臺）無創(chuàng)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（ Ion Torrent平臺）測序區(qū)空氣流向擴(kuò)增二區(qū)（乳液PCR與文庫富集區(qū)）擴(kuò)增一區(qū)（文庫擴(kuò)增與檢測區(qū)）標(biāo)本與文庫制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊NIPS檢測實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)（ Ion Torrent平臺示例，工作量較小，二區(qū)使用 2次/天）NIPS檢測實(shí)驗(yàn)室分區(qū)

40、設(shè)計(jì)（ Ion Torrent平臺示例，工作量較大，二區(qū)使用1次/天）腫瘤組織基因突變檢測實(shí)驗(yàn)室（ Illumina平臺，雜交捕獲）標(biāo)本和文庫制備區(qū)文庫擴(kuò)增與檢測區(qū)血漿分離DNA提取末端修復(fù)與純化3端加“A”尾文庫擴(kuò)增與純化文庫濃度測定連接接頭和純化電泳區(qū)測序區(qū)擴(kuò)增二區(qū)（文庫擴(kuò)增和富集）雜交捕獲區(qū)空氣流向擴(kuò)增一區(qū)文庫制備區(qū)空氣流向打斷區(qū)標(biāo)本制備區(qū)空氣流向試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向（文庫預(yù)擴(kuò)增和純化）PoolingPooling 后定量文庫終濃度空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間空氣流向緩沖間空氣流向測序區(qū)緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間上機(jī)測序測序前準(zhǔn)備（克隆或簇生成）數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解讀、報(bào)告審

41、核及發(fā)放專用走廊無創(chuàng)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷 各分區(qū)所對應(yīng)的檢測流程Illumina 平臺雜交捕獲法腫瘤基因突變 NGS檢測流程舉例腫瘤組織基因突變檢測實(shí)驗(yàn)室（ Ion Torrent 平臺，多重PCR） 試劑制備、貯存；試劑準(zhǔn)備 消耗品準(zhǔn)備、貯存 核酸提?。ù胖榛蛑幔┘?片段化及其檢測 （組織樣本，可單設(shè) 打斷區(qū)，檢測可在電泳區(qū)）標(biāo)本制備 末端修復(fù)和加 “A”文庫制備 接頭（adapter ）連接：連接產(chǎn)物磁珠純化（加標(biāo)簽 index） 純化產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增（一次擴(kuò)增）擴(kuò)增一區(qū) 擴(kuò)增產(chǎn)物純化，Qubit檢測文庫濃度，Agilent2100 檢測文庫片段大?。稍陔娪緟^(qū)完成） 磁珠法純化連接文庫產(chǎn)

42、物雜交捕獲區(qū) 雜交捕獲，洗脫 前述雜交捕獲產(chǎn)物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增富集，Agilent2100 檢測文庫片段大?。稍陔娪緟^(qū)完成） PCR檢測文庫濃度擴(kuò)增二區(qū) 測序前文庫pooling 上機(jī)測序（2hr） 數(shù)據(jù)分析（Key signal 、Total reads 、Usable reads 、Polyclonal 與低質(zhì)量序列在合理范圍內(nèi)、測序長度、測序深度、在靶率、擴(kuò)增不均一度等）測序（一代、二代）132018-5-14PGM或ION PROTON 平臺腫瘤組織基因突變檢測為例（多重 PCR）試劑制備、貯存；消耗品準(zhǔn)備、貯存標(biāo)本和文庫制備區(qū)DNA提取DNA片段化DNA片段大小分析雜交捕獲打斷區(qū)試

43、劑準(zhǔn)備標(biāo)本制備3端加“A”尾連接接頭與純化末端修復(fù)與純化純化及定量檢測電泳區(qū)核酸提?。ù胖榛蛑幔U(kuò)增一區(qū)文庫預(yù)擴(kuò)增與純化擴(kuò)增后定量檢測雜交捕獲區(qū)多重PCR（所需片段擴(kuò)增， 200bp擴(kuò)增二區(qū)測序區(qū)Pooling文庫定量檢測文庫擴(kuò)增（即簇形成）與富集Sanger測序PCR與純化洗脫與純化多重PCR及相物消化引物消化上機(jī)測序（高通量測序和 Sanger測序驗(yàn)證）數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解讀報(bào)告審核及發(fā)放 加adapters或Barcode Adapters （可有96種，一人份一種） 磁珠法純化連接文庫產(chǎn)物 文庫定量文庫制備 poolingOne touch 上擴(kuò)增（60 cycles，油包水，引物上加

44、biotin）堿變性，包被有親合素磁珠吸附生物素化的單鏈腫瘤基因突變檢測各分區(qū)所對應(yīng)的檢測流程測序前擴(kuò)增上機(jī)測序（2hr）數(shù)據(jù)分析（Key signal 、Total reads 、Usable reads 、Polyclonal 與低質(zhì)量序列在合理范圍內(nèi)、測序長度、測序深度、在靶率、擴(kuò)增不均一度等）測序（一代、二代）標(biāo)本制備三區(qū)（病原體 NDA提?。┰噭?zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備二區(qū)（組織DNA提取）打斷區(qū)文庫制備二區(qū)（組織文庫制備）擴(kuò)增三區(qū)雜交捕獲二區(qū)擴(kuò)增四區(qū)（文庫預(yù)擴(kuò)增和純化）（文庫預(yù)擴(kuò)增、富集和定量）（Sanger測序PCR和純化）（病原體 qPCR定量）空氣流向緩沖間空氣流向空氣流向空氣流向空氣

45、流向緩沖間空氣流向緩沖間空氣流向緩沖間空氣）流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊專用走廊緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向測序區(qū)空氣流向電泳區(qū)標(biāo)本制備一區(qū)（ctDNA提取）文庫制備一區(qū)（ctDNA文庫制備）擴(kuò)增一區(qū)雜交捕獲一區(qū)擴(kuò)增二區(qū)（文庫預(yù)擴(kuò)增和純化）（文庫擴(kuò)增、富集和定量）多檢測項(xiàng)目、多檢測平臺共存的高通量測序?qū)嶒?yàn)室設(shè)計(jì)示例同時開展病原體檢測、腫瘤基因突變組織學(xué)樣本和循環(huán)腫瘤 DNA樣本檢測項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室樣本號基因名稱NGS結(jié)果外顯子突變頻率ALKEGFRFGFR3IDH1EML4ENST00000318522:r.1_929+220_

46、ALKENST00000389048:r.4080_6220NM_005228.3(EGFR):c.493CT(p.Arg165Trp)NM_000142.4(FGFR3):c.1948AC(p.Lys650Gln)E6:E2010%50%50%50%腫瘤基因突變NGS質(zhì)評41441501RETFGFR2PTPN11KIF5BENST00000302418:r.1_2183_RETNM_020975:r.2327_5629NM_000141.4(FGFR2):c.1124AG(p.Tyr375Cys)NM_002834.3(PTPN11):c.182AG(p.Asp61Gly)E15:E129

47、320%50%20%15021503ROS1SDC4ENST00000372733:r.1_239_ROS1NM_002944:r.5448_7368E2:E3210%TP53BRAFEGFRNM_000546.5(TP53):c.448_459del12(p.Thr150_Pro153del)NM_004333.4(BRAF):c.1799TA(p.Val600Glu)NM_005228.3(EGFR):c.2573TG(p.Leu858Arg)5152150%20%50%所有樣本均為人基因組DNA（從細(xì)胞中提取），樣本量30l，濃度3050ng/l。其中，1501-1508 號樣本檢測體細(xì)

48、胞突變，提供正?；蚪MDNA一份（樣本編號為15NC），15NC代表臨床上來自患者外周血或者正常組織樣本中提取的基因組DNA。FLT3KRASNM_004119.2(FLT3):c.2520_2521insGGATCC(p.Ser840_Asn841insGlySer)NM_033360.3 (KRAS):c.34GC(p.Gly12Arg)20250%10%ALKEGFRERBB2EML4ENST00000318522:r.1_1751_ALKENST00000389048:r.4080_6220NM_005228.3(EGFR):c.2237_2254del18(p.Glu746_Ser7

49、52delinsAla)NM_004448.2(ERBB2):c.2263_2264TTCC(p.Leu755Pro)E13:E201920%50%50%191504NOTCH1NRASNM_017617.3(NOTCH1):c.5965GA(p.Asp1989Asn)NM_002524.4(NRAS):c.35GA(p.Gly12Asp)32250%20%PDGFRAAKT1NM_006206.4(PDGFRA):c.1664AG(p.Tyr555Cys)NM_001014432.1(AKT1):c.49GA(p.Glu17Lys)12250%50%15051506PDGFRAKRASEGF

50、RJAK2NRASGNASHRASJAK2NM_006206.4(PDGFRA):c.1681_1682insAGAGGG(p.Arg560_Val561insGluArg)NM_004985.3(KRAS):c.34GT(p.Gly12Cys)NM_005228.3(EGFR):c.2156GC(p.Gly719Ala)NM_004972.3(JAK2):c.1821GC(p.lys607Asn)NM_002524.4(NRAS):c.38GA(p.Gly13Asp)NM_000516.4(GNAS):c.601CA(p.Arg201Ser)NM_005343.2(HRAS):c.181CA

51、(p.Gln61Lys)NM_004972.3(JAK2):c.1821GC(p.Lys607Asn)12218142831420%1%50%50%50%20%50%50%15071508KITPIK3CANM_000222.2(KIT):c.1675_1680delGTTGTT(p.Val559_Val560del)NM_006218.2(PIK3CA):c.1624GA(p.Glu542Lys)111020%10%ALKKIF5BENST00000302418:r.1_3219_ALKNM_004304:r.4080_6222E24:E2020%BRAFIDH2JAK2NM_004333.

52、4(BRAF):c.1405_1407del3(p.Gly469del)NM_002168.2(IDH2):c.419GA(p.Arg140Gln)NM_004972.3(JAK2):c.1849GT(p.Val617Phe)1141420%1%50%142018-5-14表. 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)評成績情況不同panel的實(shí)驗(yàn)室數(shù)PT成績（分）評價結(jié)果801006080060（按基因數(shù)分類）總計(jì)100408合格不合格（含80）（含60）（不含0）4032103714182040(含20)1020(含10) 2000X )實(shí)驗(yàn)室回報(bào)的方法學(xué)包括 NGS、ARMS 和數(shù)字 PCR，回報(bào)的實(shí)驗(yàn)室百分比分別為

53、63.2%（43/68）、 20.6%（14/68）和 16.2%（11/68）。實(shí)驗(yàn)室總體檢測情況良好，符合率為 82.4%（56/68），50.0%的實(shí)驗(yàn)室 PT 成績?yōu)?100 分。其中，采用數(shù)字 PCR 法的實(shí)驗(yàn)室符合率 100%（11/11），高于 NGS 79.1%（34/43） 和 ARMS方法78.6%（11/14）。Simulated tumor-normal pairs ( BAMEditor )Proficiency testing for bioinformatics analysisProficiency testing for bioinformatics anal

54、ysisMutation types: SNV (single nucleotide variant) INDEL (small insertions and deletions 1000 bp) CNV (copy number variation) Mutation frequency (2% - 35%)Platforms for labsIlluminaIon torrentBGISeq500162018-5-14Somatic mutation detection accuracyCONCLUSIONS:Validating and monitoring clinical NGS實(shí)驗(yàn)

55、室可參考的一些指南性文件bioinformatics pipeline is important.Greater difficulty in indel calling over SNVcalling.Difficulty in low frequency variants detection.Comparison of the two results美國CLSI制訂的一些與分子檢測有關(guān)的導(dǎo)則或指南個體化醫(yī)學(xué)檢測管理辦法及相關(guān)指南和導(dǎo)則的制訂分工項(xiàng)目名稱內(nèi)容1CLSI/NCCLS MM1ACLSI/NCCLS MM2-A2CLSI/NCCLS MM3-P2CLSI/NCCLS MM5-ACLS

56、I/NCCLS MM6基因疾病的分子診斷方法23免疫球蛋白和T細(xì)胞基因重排檢測傳染性疾病的分子診斷方法分子血液病理學(xué)的核酸擴(kuò)增檢測傳染性疾病定量的分子檢測方法醫(yī)學(xué)遺傳檢測中熒光原位雜交方法實(shí)驗(yàn)室診斷醫(yī)學(xué)中的核酸測序方法傳染性疾病的基因分型指南名稱負(fù)責(zé)人藥物代謝與效應(yīng)基因多態(tài)性檢測相關(guān)技術(shù)指南腫瘤相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)指南周宏灝院士詹啟敏院士曾益新院士曾溢滔院士456CLSI/NCCLS MM7-ACLSI/NCCLS MM9-ACLSI/NCCLS MM10-PCLSI/NCCLS MM12-PCLSI/NCCLS MM13-ACLSI/NCCLS MM14-ACLSI/NCCLS MM14

57、-A2CLSI/NCCLS MM16-PCLSI/NCCLS MM20-A遺傳病相關(guān)個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)指南病原微生物相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)指南芯片技術(shù)的個體化醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)指南測序技術(shù)的個體化醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)指南原位雜交技術(shù)的個體化醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)指南個體化醫(yī)學(xué)檢測LDT的相關(guān)技術(shù)指南7尚程于陳程尚紅教授京院士軍教授杰教授京院士紅教授89診斷用核酸芯片1011121314分子診斷方法中標(biāo)本收集、運(yùn)輸、處理和儲存分子診斷方法中的能力驗(yàn)證分子檢測能力驗(yàn)/室間質(zhì)量評價設(shè)計(jì)外源RNA對照用于基因表達(dá)檢測分子遺傳檢測的質(zhì)量管理個體化醫(yī)學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)室管理辦法李金明教授美國FDA制訂的一些與NGS有關(guān)的導(dǎo)則或指南項(xiàng)目名稱內(nèi)容1Use of Standards in FDAs Regulatory O