醫(yī)學(xué)Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳細(xì)版專題課件

1、Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳細(xì)版定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法Western Blot基本原理 在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然

2、后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)?？焖佟⑻禺?，信號(hào)弱、昂貴信號(hào)強(qiáng)、二抗選擇多，非特異性結(jié)合Western Blot一般流程SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備裂解液只能識(shí)別非變性的抗原表位的抗體，不能選擇SDS及強(qiáng)去污劑的裂解液研究蛋白之間相互作用，應(yīng)選擇溫和非變性裂解液對(duì)于難溶解蛋白，應(yīng)選用裂解強(qiáng)度更高的裂解液（如RIPA, SDS)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來(lái),而以硫酸根離子外露與水

3、分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過(guò)硫酸銨(時(shí)間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠濃度與蛋白分離范圍安裝玻璃板對(duì)齊、加緊配膠混勻、不要過(guò)度，防止氧化轉(zhuǎn)膜NC膜PVDF膜結(jié)合能力80-110 ug/cm2125-200 ug/cm2材料質(zhì)地脆韌性好溶劑耐受性無(wú)有操作程序緩沖

4、液潤(rùn)濕100%甲醇潤(rùn)濕價(jià)格便宜較貴大于20KD0.45 um小于20KD0.2 um小于7KD0.1 um轉(zhuǎn)膜半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間。（小分子量蛋白）濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。（大分子量蛋白） 不能有氣泡不要污染膜的表面注意正負(fù)極冰浴冷卻濕轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn)不能有氣泡濾紙、膠、膜大小要一致，否則容易短路，產(chǎn)熱封閉脫脂奶粉（5）BSAWestern Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供）一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37一小時(shí)，4 過(guò)夜。倒掉一抗

5、溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 37一小時(shí)，4 過(guò)夜。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)DAB 顯色法：方便、經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)慢、不易保存、不能重新剝離檢測(cè)ECL發(fā)光法：靈敏、快速、反應(yīng)快、能重新剝離檢測(cè)Western Blot常見(jiàn)問(wèn)題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊條帶比正常的窄？“

6、微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？ 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之間墊上少許普通的濾紙確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫背景太高膜沒(méi)有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過(guò)高 原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度沒(méi)有陽(yáng)性條帶或比較弱抗體染色不充分靶蛋白含量太低HRP抑制劑轉(zhuǎn)膜時(shí)間不夠曝光時(shí)間過(guò)短 原因?qū)Σ咴黾涌贵w滴度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間增加樣本上樣量所用溶液和