藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓 7-二代測序產(chǎn)品質(zhì)量控制及思考 中檢院

1、二代測序產(chǎn)品質(zhì)量控制及思考黃杰非傳染病診斷試劑室中國食品藥品檢定研究院報告內(nèi)容二代測序診斷試劑產(chǎn)品試劑標準化方案及臨床問題面臨的挑戰(zhàn)測序發(fā)展歷程正在研發(fā)2005年開始20世紀80年代中期第三代DNA測序技術是以單分子測序為特點，如生物科學公司的單分子測序儀，以及正在研制的太平洋生物科學公司的單分子實時DNA測序技術和牛津納米孔技術公司的納米孔單分子測序技術等主要包括羅氏454公司的454測序技術 、Illumina公司的Solexa測序技術和Life Technologies公司的Ion Torrent測序技術 。第二代測序技術最顯著的特征是高通量，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測

2、序傳統(tǒng)的化學降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎上發(fā)展來的測序技術統(tǒng)稱為第一代測序。它在分子生物學研究中發(fā)揮過重要的作用，如人類基因組計劃目前常說的高通量測序是指用第二代測序技術來進行測序，第三代測序技術還不是很成熟，有的剛剛出現(xiàn)，有的則正在研制。NGS臨床應用外來基因致病基因感染 腫瘤生育 遺傳突變基因易感基因 NIPT （無創(chuàng)產(chǎn)前檢驗） 胚胎植入前篩查（PGS）、PGD 腫瘤：肺癌，結直腸癌，乳腺癌 遺傳性耳聾、地貧 人乳頭瘤病毒核酸分型 HLA分型： 移植前配型 藥物基因組學 法醫(yī) .CFDA已批準的部分NGS測序儀和試劑盒序號產(chǎn)品名稱注冊證號1234567國食藥監(jiān)械(準)字2014

3、3401126基因測序儀基因測序儀基因測序儀基因測序儀基因測序儀基因測序儀第號國食藥監(jiān)械(準)字2014 3401127第號國械注準國械注準國械注準國械注準20143401961201434021712015340030920153400460胎兒染色體非整倍體劑盒(半導體測序法)(T21 T18 T13)檢測試 國食藥監(jiān)械 準 字、( ) 2014 3401128第號8(T21 T18 T13) ( ) 2014 3401129檢測試 國食藥監(jiān)械 準 字 第胎兒染色體非整倍體劑盒(聯(lián)合探針鉚釘連接測序法)、號9(T21 T18 T13)20153400300胎兒染色體非整倍體劑盒(半導體測序

4、法)、檢測試 國械注準1011(T21 T18 T13)2014340196020153400461胎兒染色體非整倍體劑盒(半導體測序法)、檢測試 國械注準胎兒染色體非整倍體盒(可逆末端終止測序法)(T13/T18/T21)檢測試劑 國械注準報告內(nèi)容二代測序診斷試劑產(chǎn)品試劑標準化方案及臨床問題面臨的挑戰(zhàn)NGS 檢測分為實驗操作和數(shù)據(jù)分析SPECIMENT 樣本樣本處理 數(shù)據(jù)庫 算法 分析軟件擴增均勻度及偏倚性建庫文庫的質(zhì)量準確性DNA/RNALIBRARY 文庫特異性檢測限SEQUENCING 測序BASECALLING 堿基鑒別ALIGNMENT 拼接過濾參數(shù)及準確性參考序列或參考數(shù)據(jù)庫VA

5、RIANT CALLING 突變鑒別ANNOTATION/FILTERING/CLASSIFICATION 交叉 解讀可靠性確認報告范圍及內(nèi)容INTERPRETATION 解讀REPORT 報告高通量測序儀器性能標準化半導體測序SOLiD鏈接酶測序Illumina可逆末端終止測序PacBioCompleteGenomicsNanoporePGM/Proton454聯(lián)合探針錨定合成測序 焦磷酸測序Sequencing using semi-conductor chipSequencing forsingle moleculeSequencing using CCD測序儀性能評價用基因組DNA國家

6、參考品采用實物與參考序列的方式進行評價，將參考序列作為了標準技術指標：測序儀性能評價用脫氧核糖核酸參考品技術指標（二代測序儀評價）：1.測序準確性2.重復性測序儀性能評價用脫氧核糖核酸參考品技術指標（一代測序儀評價）：1.測序準確性2.重復性2.5G參考品30M參考品原始數(shù)據(jù)Length30,324,0622,495,071,5683,095,693,981GC39.90%50.98%43.28%8.54%40.90%50.35%RepeatGapLength%0.00%80.60%0.00%0.98%7.66%-人基因組標準品序列在各染色體的分布，第二圈藍色為標準品選擇區(qū)域，第三圈灰色為Ga

7、p區(qū)域NGS檢測試劑標準化質(zhì)量控制技術評價指南基于孕婦游離DNA的胎兒染色體非整倍體檢測試劑質(zhì)量控制技術評價指南（高通量測序法）胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑的質(zhì)量控制技術評價指南(高通量測序法) 高通量測序檢測外周血胎兒染色體非整倍體試劑標準化 胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)基本特點：來源：1） 含量有一定的變化規(guī)律。妊娠第5周開始可檢出胎兒游離DNA，隨著孕周增加而增加，但存在個體差異；1 胎兒細胞通過胎盤滲透到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，胎兒DNA殘留下來；2）分娩后短時間內(nèi)消失，平均半衰期為16.3min (4-30min)， 2h就無法檢出。再次妊娠不影響檢測結果；2 胎兒細胞凋亡；3 胎盤

8、滋養(yǎng)層細胞的凋亡。3） DNA片段較小，平均166bp左右。常規(guī)技術很難檢測。高通量測序檢測外周血胎兒染色體非整倍體以21-三體為例：100 DNA單位 /毫升血漿。其中，95個單位來源于母親， 5個單位來源于胎兒母親Chr 21：952=190正常胎兒Chr 21：52=10母體外周血中Chr 21=190+10=200經(jīng)過計數(shù)與比較： 正常胎兒 或者 21-三體胎兒母親Chr 21：952=19021-三體胎兒Chr 21：53=15母體外周血中Chr 21=190+15=205Fan et al., PNAS, 2008Chiu et al., PNAS, 2008技術和產(chǎn)品影響因素分析

9、母親外周血中胎兒游離DNA的含量胎兒三體的不同類型如標準三體、嵌合體以及平衡易位突變DNA序列差異對結果有影響，特別是高GC含量序列對結果文庫構建中的偏移，測序文庫的庫容和量在軟件分析中采用的算法主要基于統(tǒng)計學原理，在結果分析中原始數(shù)據(jù)是否符合統(tǒng)計學要求女胎、雙胞胎以及多胞胎對結果的影響孕婦本人為“染色體非整倍體”患者，夫婦雙方或一方為染色體結構異常者孕婦前期接受過異體輸血、移植手術、干細胞治療等引入的外源DNANIPT定量方法比較 胎兒游離DNA濃度測定：QubitAgilent 2100片段長度估計算法Y染色體法多重SNP法（熒光PCR法/數(shù)字PCR ）保守基因檢測法（熒光PCR法）胎兒D

10、NA濃度定量-片段長度Size ratio=P(100-150)/P(163-169)P(100-150) 100-150bp片段的比例P(163-169) 163-169bp片段的比例 受建庫過程的影響胎兒DNA濃度定量-甲基化Step 2: 甲基化特異性的RE消化Step 1: 游離DNA提取非甲基化的母體 DNA（C）甲基化的胎兒 DNA （D）Step 4: 核酸質(zhì)譜分析反應產(chǎn)物CStep 3: 競爭性PCR和單堿基延伸D胎兒濃度與孕周 98%以上樣本胎兒濃度4% 胎兒濃度和孕婦孕周正相關 胎兒濃度與孕婦體重負相關NIPT算法介紹目前NIPT數(shù)據(jù)分析算法主要包括以下三種，這三種算法的主

11、要差異在于使用了不同的方法構建參考數(shù)據(jù)庫。 常規(guī)U檢驗算法 NCV(Normalized Chromosome Value)算法 MAD(Median Absolute Deviation)算法參考文獻：1. Chiu RWK, et al. (2008) Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA inmaternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA2. Amy J. Sehnert,

12、et al. (2011) Optimal Detection of Fetal Chromosomal Abnormalities by Optimal Detection of Fetal ChromosomalAbnormalities by from Maternal Blood. Clinical Chemistry3. Glenn E. Palomaki, et al. (2011) DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation stud

13、y.Genetics IN Medicine模擬不同測序數(shù)據(jù)量對檢出影響高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18和T13）國家參考品 數(shù)據(jù)量控制參考品 陽性參考品 微缺失微重復參考品 嵌合體參考品 檢測限參考品 陰性參考品NIPT的假陰性、假陽性Biological/Technical explanation (n=60, 33%)False positives(n=182, 88%)T21 (n=65, 36%)T18 (n=59, 32%)T13 (n=47, 26%)Maternal CNV (n=29, 48%)CPM (n=19, 32%)Maternal maligna

14、ncy (n=9, 15%)Maternal mosaicism (n=1, 2%)Vanished twin (n=1, 2%)T9 (n=1, 0.5%)T22 (n=1, 0.5%)Maternal and fetal Chr 21 duplication (n=1, 2%)Monosomy 18 (n=1, 0.5%)Multiple (n=8, 4%)No explanation (n=122, 67%)Included cases(n=206)False negativesBiological/Technical explanation (n=13, 54%)TFM T21 (n=

15、3, 23%)(n=24, 12%)T21 (n=10, 42%)T18 (n=9, 38%)TFM T18 (n=5, 38%)TFM T13 (n=2, 15%)TFM multiple aneuploidies (n=2, 15%)Incorrect annotation (n=1, 8%)T13 (n=3, 13%)48, XXX, +18 (n=1, 4%)47, XY, +21/48, XY, +18, +21(n=1, 4%)No explanation (n=11, 46%)TFM: True fetal mosaicismHartwig TS. Prenat Diagn. 2

16、017 Apr 5. doi: 10.1002/pd.5049.NIPT與移植、免疫治療 After organ transplantation, donor-derived cell-freeDNA (ddcfDNA) can be detected in the recipient sblood and urineGielis EM. Am J Transplant. 2015 Oct;15(10):2541-51. doi: 10.1111/ajt.13387.De Vlaminck I. Sci Transl Med. 2014 Jun 18;6(241):241ra77. doi:

17、10.1126/scitranslmed.3007803.NIPT與核型不一致（母體腫瘤）Amant F, et al. JAMA Oncol. 2015 Sep;1(6):814-9.Bianchi, DW, et al. JAMA. 2015 Jul 14;314(2):162-9.NIPT熱點議題NIPT，即無創(chuàng)產(chǎn)前檢測，Non-invasive Prenatal Testing首字母縮寫主流檢測技術是對孕婦外周血漿cffDNA 高通量測序分析ISPD 2013：Should noninvasive DNA testing be the standard screening test f

18、orDown syndrome in all pregnant women?NIPT常規(guī)用于所有孕婦？ISPD 2014 ：NIPT for chromosome abnormality should be offered to womenwith low a priori riskNIPT染色體異常檢測提供給低先驗風險的孕婦？ISPD 2015 ：NIPT should be routinely include microdeletions /duplicationsNIPT應常規(guī)檢測微缺失微重復？NIPT檢測染色體亞顯微異常ESHG-ASHGACOG（美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會）ISPD（歐洲人類

19、遺傳學學會-（國際產(chǎn)前診斷學會）美國人類遺傳學學會）2015.6 26 在線發(fā)表（取代2012版）2015.6 4在線發(fā)表（取代2013版）2015.3.18在線發(fā)表建議建議建議 不建議常規(guī)用于微缺失 檢測應限于臨床意義明 尚不推薦擴大NIPT檢測適應證；不否認潛在價值綜合征確的嚴重表型類別 配套專業(yè)咨詢 尚需更多評估 尚需更多評估 目標區(qū)域法有一定局限 尚需更多評估利用染色體單倍體型檢測無創(chuàng)產(chǎn)前單病 需結合父母和先證者的單倍體信息 血漿游離DNA測序確認胎兒是否遺傳了父母的致病突變 侵入性產(chǎn)前診斷確診胚胎植入前遺傳學篩查（ PGS ）試劑的標準化基于高通量測序的胚胎植入前檢測流程Datepr

20、ocessingHigh-throuputanalysisGeneticcounselingWGABiopsyIVF-ICSITransplantplatformIVF臨床促排卵胚胎選擇文庫構建遺傳咨詢卵裂球細胞生物信息學分析單細胞擴增卵子精子測序簽署知情同意書囊胚滋養(yǎng)層細胞胚胎移植ICSI檢測試劑盒質(zhì)量控制考慮的主要因素： 單細胞擴增的均一性、覆蓋度 參比數(shù)據(jù)庫的建立 數(shù)據(jù)量與結果判定 不同的檢出能力檢測全部24條染色體的全染色體組PGSDoes screening the whole chromosome complement improve IVF outcomes? Compariso

21、n of 3 trials using varying PGS technologiesDahdouh et al. 2015. Impact of blastocyst biopsy and comprehensive chromosome screening technology on preimplantation genetic screening: asystematic review of randomized control trials. RBM Online.30: 281-289COGEN PGS Statement, Sept 2015：建議所有IVF患者考慮PGS.“W

22、hilst we recognize that as yet much of the published data do not meet the veryhighest level of medical analysis, there is now a significant, and increasing bodyof scientific literature supporting the recommendation of PGS to patientsundergoing IVF, for the reasons stated above. Based on available da

23、ta PGSshould no longer be considered as an experimental procedure. We thereforebelieve that PGS should be part of the discussion with all patientsconsidering/undergoing IVF treatment ”/cogen/general/cogen-statement.htmlPGDIS Statement on Mosaicism and Preimplantation AneuploidyTesting, July 2016 Tes

24、ting embryos for abnormal copy number (aneuploidy) is now being usedincreasingly to avoid the transfer of abnormal, mostly non-viable, embryosfollowing IVF PGS has now been shown in numerous studies to improve implantation,pregnancy and live birth rates (per embryo transferred) and reduce miscarriag

25、erates For reliable detection of mosaicism, ideally 5 cells should be biopsied, with aslittle cell damage as possible Only a validated NGS platform that can quantitatively measure copy numbershould be used for measurement of mosaicism in the biopsy sample/docs/newsletter_071816.htmlPGS標準化過程2015年11月初

26、，中檢院召開了植入前胚胎染色體非整體篩查國家參考品的專家論證會，確定了國家參考品的研制方案；2016年，通過專家審評會，完成360010-201601 胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品制備和批準；2017年3月，制定了胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑的質(zhì)量控制技術評價指南(高通量測序法) ；2017年4月在北京召開2017年SAC/TC136歸口行業(yè)標準制修訂工作啟動會。PGS檢測試劑標準化質(zhì)量控制技術評價指南胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑的質(zhì)量控制技術評價指南(高通量測序法) 評價指南對PGS產(chǎn)品的設計開發(fā)要求 測試結果解釋 企業(yè)質(zhì)量控制參考品 預期用途 主要原材料構成 輔助試劑構成 測

27、試方法學測試方法的局限性參考數(shù)據(jù)庫的建立結論： 需要建立參考區(qū)間，去除基因組高重復區(qū)域或CG異常區(qū)域帶來波動 染色體拷貝數(shù)變異存在個體差異 隨著樣本數(shù)量增加，每條染色體對應窗口所包含的reads數(shù)目趨于穩(wěn)定，序列數(shù)變異系數(shù)（CV值）趨于穩(wěn)定為什么要研制PGS標準品1、臨床需求迫切2、技術方法繁多3、檢測標準多樣4、臨床應用亂象不孕不育的發(fā)病率逐年升高平臺、測序方法、數(shù)據(jù)分析不同機構的檢測范圍不一致以服務商的技術水平為主導理論依據(jù)單細胞擴增確保單細胞擴增及建庫試劑盒的穩(wěn)定性建庫成功率文庫構建最低有效數(shù)據(jù)量及基因組覆蓋率確保測序數(shù)據(jù)可滿足后續(xù)分析需求高通量測序陽性參考品符合率陰性參考品符合率嵌合體

28、參考品符合率確保檢測試劑盒和檢測算法的可靠性和準確性生物信息分析測序有效數(shù)據(jù)量及基因組覆蓋率有效數(shù)據(jù)量與數(shù)據(jù)離散度關系有效數(shù)據(jù)量越低 檢測誤差越高 檢測成本越低如何平衡？有效數(shù)據(jù)量越高 檢測誤差越低 檢測成本越高嵌合體參考品為什么設計嵌合體參考品？嵌合體在人類輔助生殖技術的早期胚胎中非常常見，其中囊胚嵌合體現(xiàn)象至少占30%。國家參考品技術指標360010-201601 胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品參考品的技術指標：要求不同高通量測序檢測系統(tǒng)（包括檢測試劑盒）進行測序文庫制備時，本套參考品建庫失敗率應不大于3%，即失敗樣本應不大于2個；同時要求對數(shù)據(jù)量控制參考品的檢測唯一比對有效數(shù)據(jù)量應不

29、低于1M，基因組覆蓋率不低于4%的前提下，達到下列技術指標：1陽性參考品符合率：異常片段大小大于4M的陽性參考品對應的染色體異常要求檢出率達到100%，異常片段大小小于等于4M的陽性參考品對應的染色體異常要求檢出率達到30%以上。2. 陰性參考品符合率：陰性參考品應不得檢出染色體異常。3. 嵌合體參考品符合率：對30%嵌合的嵌合體樣本檢出率應達到30%以上，相對應的70%嵌合體樣本檢出率應達到60%以上。4. 重復性：使用同一批次試劑盒進行三次重復實驗，要求三次實驗結果在滿足建庫失敗率和數(shù)據(jù)量參考品的條件下，每次均滿足1-3檢測要求。PGS的發(fā)展方向無創(chuàng)PGS盡管目前的研究結果上存在爭議，但由

30、于取樣過程對胚胎細胞沒有損傷，仍是很有發(fā)展前景的PGS方向。38線粒體DNA與胚胎質(zhì)量關系研究是PGS另一個發(fā)展方向胚胎細胞中線粒體含量與胚胎質(zhì)量的關系：初步研究表明二者無明顯對應關系。胚胎細胞培養(yǎng)液中線粒體含量與胚胎質(zhì)量的關系：線粒體含量越高，胚胎質(zhì)量越差。39腫瘤基因突變檢測試劑的標準化個體配對正常對照（白細胞、癌旁）腫瘤病理組織/手術標本/血漿/體液等鑒別真正的體細胞突變腫瘤突變正常多態(tài)性DNA/RNA測序測序腫瘤突變注釋遺傳解讀、用藥選擇不打斷打斷/無需打斷原始下機數(shù)據(jù)報告目標區(qū)域捕獲（液相雜交）PCR擴增生物信息分析文庫制備在普通人群中，BRCA檢測有助于鑒別罹患卵巢癌風險高的女性患

31、者，并且能夠幫助這些人群和其家屬提前制定預防策略-目前指南推薦根據(jù)家族史或在已知祖先具有突變基因的人群中進行基因檢測（如，德裔猶太人風險評估后裔）13治療方案制定在女性卵巢癌患者中，BRCA檢測有助于鑒別出對于鉑類化療敏感的患者或者適合接受靶向治療的患者（如，PARP抑制劑）預后因子除診斷分期、組織學檢查及手術切除范圍之外，BRCA突變情況是的一個重要的預后因子4,51. Balmaa J, et al. Ann Oncol 2010;21(Suppl. 5):v20v22.2. Daly M, et al. NCCN Guidelines. Genetic/familial high-ris

32、k assessment: Breast and ovarian. Version 4.2013.3. NICE clinical guideline 164. June 2013. .uk/cg164.4. Petrucell N, et al. Genetics in Medicine 2010;12(5):245-259.5. Agarwal R. and Kaye SB. Ann Oncol 2005;16: 46.目前BRCA1/2基因檢測的痛點背景：靶向藥物PARP抑制劑對于晚期乳腺癌、卵巢癌患者有良好的治療效果，美國、歐洲已經(jīng)批準藥品上市，對應BRCA1/2檢測試劑盒也已批準上市

33、。中國治療乳腺癌、卵巢癌的PARP抑制劑的靶向藥物也在可預期的時間上市，但是，目前還沒有BRCA1/2檢測的試劑盒獲批。BRCA1/2基因檢測在中國的痛點：NGS檢測出的變異有部分變異無法判斷是致病還是良性，這部分患者無法用藥得到治療。導致痛點的原因：原因一：大部分中國人特有的BRCA突變在國際數(shù)據(jù)庫中不存在；原因二：缺乏健康人群及患者人群的大型分子流行病學研究；原因三：缺乏中國人群BRCA1/2 良性變異數(shù)據(jù)庫；原因四：缺乏中國人群BRCA1/2 致病變異數(shù)據(jù)庫；如何區(qū)分致病變異和良性變異？哪些是致病？臨床意義不明哪些是良性？BRCA1/219.9萬個可能變異的位點中國人群良性變異數(shù)據(jù)庫中國

34、人BRCA1/2致病變異數(shù)據(jù)庫BRCA基因數(shù)字化參考品特點基于真實臨床樣本fastq文件vcf文件突變信息一一對應標準的解讀結果以及證據(jù)等級突變在exon的分布情況本數(shù)據(jù)庫一共收錄2843個樣本，BRCA突變750個，BRCA1基因285個，其中位于編碼區(qū)的突變269個，涉及22個exon；BRCA2基因465個，其中位于編碼區(qū)的突變449個，涉及23個exonBRCA1基因BRCA2基因200150100502502001501005000復核后突變分布分類突變個數(shù)5%7%pathogeniclikely pathogenicvus37157pathogeniclikely pathogen

35、icvus49%2315331%likely benignbenignlikely benignbenign合計387508%突變類型frameshiftnonsensesplice-5突變個數(shù)26912315118splice-3missensecoding-synonstop-gain11未報道/數(shù)據(jù)庫未記錄的變異428個致病突變/疑似致病突變中，91個是未報道或數(shù)據(jù)庫未記錄的變異。21%reportednovel79%BRCA基因突變檢測評價體系（1）NGS方法配套的檢測算法不一，檢測數(shù)據(jù)分析結果檢測準確性需要評價。（2）BRACA檢測突變位點復雜，檢測數(shù)據(jù)解讀正確性無法評價。解決方案：

36、實物參考品+標準數(shù)據(jù)庫模式BRACA基因突變位點多，突變位點檢測的準確性需要評估不同產(chǎn)品配套使用的數(shù)據(jù)庫對檢測結果分析影響大，與疾病相關的突變位點種族差異大，需要有中國人群標準數(shù)據(jù)庫進行驗證。NGS腫瘤基因突變檢測質(zhì)量控制關注點如何選擇panel藥物狀態(tài)證據(jù)等級Level 4：Level 3：已達到終點臨床試驗證據(jù)支持靶向藥物，具有可預測的分子靶點Level 1：FDA已批準檢測癌腫的靶向藥物，具有可預測的分子靶點Level 2：FDA已批準非檢測癌腫的靶向藥物，具有可預測的分子靶點未達到臨床終點，但臨床試驗證據(jù)表明具有臨床活性的靶向藥物，具有可預測的分子靶點突變靶點證據(jù)等級Level 4：僅

37、有預臨床試驗報道的與靶向藥物相關的突變Level 3：正在進行臨床試驗的靶向藥物對應突變，至少1例患者有效Level 2：Level 1：正在進行臨床試驗靶向藥物對已獲得批準的靶向藥物對應突變 應突變，且突變符合試驗標準基因突變決定腫瘤藥物敏感或耐藥靶向藥物敏感基因耐藥基因(以第一代EGFR-TKI為例)NCCN推薦吉非替尼，厄洛替尼，阿法替尼EGFR-敏感突變原發(fā)性耐藥克唑替尼，色瑞替尼ALK重排ROS1重排，MET擴增HER2突變KRAS克唑替尼獲得性耐藥阿法替尼，曲妥珠單抗達拉菲尼，威羅非尼卡博替尼BRAF突變EGFR :T790M 、 擴增等MET 擴增RET重排肺癌ALK重排EGFR T790MAZD9291BRAF臨床試驗PIK3CA安卓奎諾爾KRASPIK3CABuparlis