堿性磷酸酶值測(cè)定

1、關(guān)于堿性磷酸酶值測(cè)定第一張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)環(huán)境因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響；學(xué)習(xí)米氏方程及Km值得測(cè)定；測(cè)量堿性磷酸酶km值；實(shí)驗(yàn)原理 E的反應(yīng)速度受到環(huán)境因素的影響，這些因素包括底物濃度、E濃度、PH、溫度、激活劑、抑止劑等第二張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）米曼氏方程式中間產(chǎn)物 酶促反應(yīng)模式中間產(chǎn)物學(xué)說E + S k1k2k3ESE + P相關(guān)E學(xué)原理第三張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式，簡(jiǎn)稱米氏方程式(Michaelis equation)。

2、S：底物濃度V：不同S時(shí)的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximum velocity) m：米氏常數(shù)(Michaelis constant) VmaxS Km + S 第四張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí) Km值的推導(dǎo)KmS Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 第五張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）Km與Vmax的意義 Km值 Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。 意義：a) Km是酶的特征性常數(shù)之一；b) Km可近似表示

3、酶對(duì)底物的親和力；c) 同一酶對(duì)于不同底物有不同的Km值。 第六張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 Vmax定義：Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。第七張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）m值與max值的測(cè)定1. 雙倒數(shù)作圖法(double reciprocal plot)，又稱為 林-貝氏(Lineweaver- Burk)作圖法-1/Km 1/Vmax 1/S 1/V VmaxS Km+SV = （林貝氏方程） + 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 兩邊同取倒數(shù) 第八張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2. Hanes作圖法S S/V -Km

4、 Km/Vm 在林貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘SS/V=Km/Vmax + S/Vmax 第九張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響當(dāng)SE，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：V = K3 E0 V E 當(dāng)SE時(shí)，Vmax = k3 E 酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 第十張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低 。 溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。* 低溫的應(yīng)用酶活性0.51.02.01.

5、50 10 20 30 40 50 60 溫度 C 溫度對(duì)淀粉酶活性的影響 第十一張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月pH對(duì)反應(yīng)速度的影響最適pH (optimum pH)：酶催化活性最大時(shí)的環(huán)境pH。0酶活性 pH pH對(duì)某些酶活性的影響 胃蛋白酶 淀粉酶 膽堿酯酶 246810第十二張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月堿性磷酸酶km值的測(cè)定第十三張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月操作試劑（ml）1234562.5mM磷酸苯二鈉0.20.40.60.81.01.0蒸餾水0.80.60.40.2堿性緩沖液1.01.01.01.01.01.0混勻后，37水浴5min堿性磷酸酶0.1

6、0.10.10.10.1混勻后，37水浴15min(準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）酚試劑1.01.01.01.01.01.0堿性磷酸酶0.110%碳酸鈉3.03.03.03.03.03.0混勻后，37水浴15min,以第6管調(diào)0與650nm比色，讀取各管A值。第十四張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果管號(hào)A6501/A650s1/ s123456以上述數(shù)據(jù)雙倒數(shù)作圖，求出堿性磷酸酶的Km值。第十五張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)討論Km值的定義和意義是什么？米氏方程度表達(dá)式是什么，如何求出Vmax和Km？第十六張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月現(xiàn)有某待測(cè)樣品液5ml，將其稀釋到100ml，取其稀釋液1ml加入測(cè)定管按酚試劑法測(cè)其蛋白質(zhì)含量，另取已知濃度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入標(biāo)準(zhǔn)管，其余操作同測(cè)定管。反應(yīng)顯色后測(cè)得吸光度分別為：A測(cè)