08章 真核生物的遺傳分析

1、第八章 真核生物的遺傳分析1本章要掌握的主要內(nèi)容第一節(jié)真核生物基因組及其復(fù)雜性真核生物基因組的特點(diǎn)重復(fù)序列的分類DNA序列分析方法與結(jié)構(gòu)基因組學(xué)第二節(jié)基因家族基因家族的類型，基因家族的特點(diǎn)第三節(jié)遺傳標(biāo)記2第一節(jié)真核生物基因組及其復(fù)雜性3一、真核生物基因組的特點(diǎn)真核生物基因組（Eukaryotic Genome, EG）與原核生物基因組（Prokaryotic Genome, PG）相比有很大差異：（1）EG位于細(xì)胞核中，由數(shù)條具有多級(jí)空間結(jié)構(gòu)的染色體組成；（2）具有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，基因內(nèi)有內(nèi)含子；（3）存在著大量的非編碼DNA序列；4（4）編碼蛋白質(zhì)的基因多位于單拷貝序列中，同時(shí)還有大量的重復(fù)序

2、列；（5）具有基因家族和基因簇；（6）具有生命所必須的細(xì)胞器基因組5二、基因組序列的分類（一）單一序列（Unique sequence） 又稱非重復(fù)序列（nonrepetitive sequence），在基因組中只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝的DNA序列，大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因都屬于這一類。6（二）重復(fù)序列1、串聯(lián)重復(fù)DNA序列 只存在于真核基因組，由2200bp的重復(fù)單位組成7可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列Variable number of tandem repeat,VNTR衛(wèi)星DNA中，有一類重復(fù)單位在1160bp，總長(zhǎng)度為幾百到幾千bp的重復(fù)序列，多位于近端粒處根據(jù)重復(fù)單位的大小又可分為：衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA

3、和微衛(wèi)星DNA三類，這類DNA多不具備轉(zhuǎn)錄能力8（二）重復(fù)序列1、串聯(lián)重復(fù)DNA序列衛(wèi)星DNA（Satellite DNA）在進(jìn)行密度梯度離心時(shí)，某些高度重復(fù)DNA序列由于堿基組成和浮力密度與主體DNA有區(qū)別，會(huì)形成一系列的衛(wèi)星帶主帶：多由單拷貝序列組成，GC含量接近于基因組均值衛(wèi)星DNA9衛(wèi)星DNA一般位于異染色質(zhì)區(qū)，通常位于著絲粒在染色體中可能有某種結(jié)構(gòu)功能長(zhǎng)度為100kb數(shù)Mb10小衛(wèi)星DNA核心重復(fù)序列由1025bp組成總長(zhǎng)度為0.130kb多位于靠近染色體末端的區(qū)域，也稱端粒小衛(wèi)星，11微衛(wèi)星DNA由16個(gè)核苷酸為核心序列分散于整個(gè)基因組總長(zhǎng)度150bp12（二）重復(fù)序列2、散布的重

4、復(fù)DNA序列在高度分散的重復(fù)DNA家族中含有少量轉(zhuǎn)座元件，根據(jù)大小不同，可分為短散布核元件（short interspersed nuclear element, SINE）長(zhǎng)散布核元件（ long interspersed nuclear element, LINE ）13三、 DNA序列分析方法DNA 測(cè)序技術(shù)早在DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)(Watson and Crick, 1953) 發(fā)現(xiàn)后不久就有報(bào)導(dǎo)(Whitfeld,1954)，當(dāng)時(shí)的測(cè)序的方法為降解法(sequencing by degradation, SbD)，但由于操作復(fù)雜，并沒(méi)有形成規(guī)模化的應(yīng)用。141965，Cornall大學(xué)

5、以SWHolle為首的科學(xué)家小組，首次完成75個(gè)核苷酸的酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定。即利用各種RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，經(jīng)分離純化后，再分別測(cè)定短片段順序。151968年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士（DrRay Wu） 獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計(jì)出一種嶄新的引物一延伸測(cè)序策略，并于1971年首次成功地測(cè)定了噬菌體兩個(gè)COS末端的完整序列；1977，F(xiàn). Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測(cè)定DNA序列的末端中止法；K. Mullis采納他的方法，完善了PCR擴(kuò)增DNA的方法；MSmith發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。16Sanger 等(1977)：末端終止法

6、，該技術(shù)引入了聚合酶和測(cè)序膠，使DNA 測(cè)序走向了大規(guī)模實(shí)用化。經(jīng)過(guò)Melamede, 1985; Cheesman, 1991;Metzker et al., 1994等改良后成為迄今為止應(yīng)用最為廣泛的測(cè)序技術(shù)。隨著技術(shù)的改進(jìn)和創(chuàng)新(Ju et al., 2000;Church, 2002; Barnes et al., 2002; Mitra et al., 2003)，聚合酶測(cè)序法又有了新的發(fā)展。17另外，還有許多其他的測(cè)序策略：如連接酶測(cè)序法(sequencing by ligation, SbL) (Whiteley et al., 1984; Landegren and Hood,

7、 1988;Drmanac, 1992)、焦磷酸測(cè)序法(pyrosequencing) (Hyman,1988)雜交測(cè)序法(sequencingbyhybridization, SbH) (Drmanac et al., 1989; 1998; 2001)181、Sanger測(cè)序法雙脫氧末端終止法利用DNA聚合酶的兩種酶催反應(yīng)特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補(bǔ)鏈；2、利用2，3雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長(zhǎng)。有時(shí)也稱引物合成法，或酶催引物合成法。19反應(yīng)：同時(shí)加入引物和模板、DNA聚合酶I、一種ddNTP、以及四種dNTP（有一種帶放射性標(biāo)記）。

8、變性膠電泳分離反應(yīng)混合物。放射自顯影術(shù)，檢測(cè)單鏈DNA片段的放射性帶。結(jié)果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。20GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTP ddATP ddGTP ddTTPAGTCAGGATCACC21在實(shí)際的DNA合成反應(yīng)中，使用失去了5 3核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。適當(dāng)?shù)卣{(diào)整ddNTP和dNTP的比例，便能夠獲得良好的電泳譜帶模式。dNTPddNTP=1：100時(shí)，譜帶分離效果較佳，可讀出多于 200個(gè)以上的核苷酸順序。222、化學(xué)降解法1977年由美國(guó)哈佛大學(xué)的AMMaxam和W Gilber

9、t發(fā)明，于1980年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)23原 理1、利用末端標(biāo)記使待測(cè)DNA帶放射性，2、利用不同化學(xué)藥品使DNA分別在特定堿基處斷裂，3、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各組大小不同的DNA片段，根據(jù)特定的斷裂位置讀出DNA序列2425第二節(jié)基因家族真核基因組中來(lái)源相同，結(jié)構(gòu)相似，功能相關(guān)的一組基因?？赡苡赡骋还餐嫦然?ancestral gene)經(jīng)重復(fù)(duplication)和突變產(chǎn)生。家族成員可以分布于不同染色體上可集中于一條染色體上，串聯(lián)排列在一起，形成基因簇(gene cluster)有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這種基因稱為假基因(Pseudogene)26根據(jù)分布形式分基因簇和

10、散布的基因家族：A 基因簇（gene cluster）基因家族的各個(gè)成員緊密成簇排列成大段的串聯(lián)重復(fù)單位，分布在某一條染色體的特殊區(qū)域；它們可同時(shí)發(fā)揮作用，合成某些蛋白質(zhì)。如 組蛋白基因家族聚集在第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)內(nèi)27Histone gene family 組蛋白基因家族28假基因（pseudo gene）：具有與功能基因相似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，所以假基因是沒(méi)有功能的基因，用表示。來(lái)源：一般認(rèn)為是由mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后整合在基因組中，假基因不含內(nèi)含子。2930B 散布的基因家族（interspersed gene family）概念：一個(gè)基因家族的不同成

11、員成簇地分布不同染色體上，各成員在序列上有明顯差異。這些不同成員編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因家族。31根據(jù)基因家族在基因組中的復(fù)雜程度分類321）簡(jiǎn)單基因家族 特點(diǎn)： 家族成員串聯(lián)排列在一起 組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位 代表: rRNA基因家族 (重復(fù)單元28S、18S、5.8s-rRNA)332）復(fù)雜基因家族 特點(diǎn)： 相關(guān)基因家族排列在一起，之間有間隔序列， 獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位 代表: 組蛋白基因家族間隔區(qū)343）發(fā)育相關(guān)復(fù)雜基因家族特點(diǎn)： 分布在不同的染色體上 獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位 基因順序與表達(dá)順序相關(guān)代表:珠蛋白基因家族35根據(jù)基因家族成員序列的相似程度分類A 經(jīng)典的基因家族，家族成員序列

12、有高度的同源性，序列一致，拷貝數(shù)高，非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)短而一致。B 基因家族各成員的編碼產(chǎn)物保守（大段的高度保守氨基酸序列）；只是DNA序列的相似性低。C 基因家族各成員的編碼產(chǎn)物之間只有很短的保守氨基酸序列，DNA序列的相似性更低。D 超基因家族，各基因序列之間無(wú)同源性，但其基因產(chǎn)物的功能相似。編碼產(chǎn)物之間也無(wú)明顯的保守氨基酸序列，但也有一些共同特征。36第三節(jié)遺傳標(biāo)記一、遺傳標(biāo)記的發(fā)展二、分子遺傳標(biāo)記三、分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用37一、遺傳標(biāo)記的發(fā)展1、形態(tài)學(xué)標(biāo)記2、細(xì)胞遺傳標(biāo)記3、生化與免疫遺傳標(biāo)記4、分子遺傳標(biāo)記5、理想的分子遺傳標(biāo)記應(yīng)具備的特點(diǎn)381、形態(tài)學(xué)標(biāo)記形態(tài)學(xué)標(biāo)記(morphologic

13、al marker)能夠用肉眼識(shí)別和觀察、明確顯示遺傳多樣性的外觀性狀。特點(diǎn)簡(jiǎn)單直觀，但標(biāo)記數(shù)目少，多態(tài)性低，易受外界條件的影響；依據(jù)它進(jìn)行選擇的準(zhǔn)確性差，所需時(shí)間較長(zhǎng)，選擇效率也較低。39古代形態(tài)學(xué)標(biāo)記公元前4000年，伊拉克的古代巴比倫石刻上記載了馬頭部性狀在個(gè)世代的遺傳。40伯樂(lè)相馬按圖索驥412、細(xì)胞遺傳標(biāo)記細(xì)胞遺傳標(biāo)記(cytological genetic marker)主要是指染色體核型（染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等）、帶型（Q、G、C、R帶型）和數(shù)量特征的變異等，它們分別反映了染色體在結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。42家豬X、Y染色體G帶示意圖43細(xì)胞遺傳標(biāo)記

14、的特點(diǎn)不易受環(huán)境影響，呈孟德?tīng)柗绞竭z傳。多態(tài)性集中表現(xiàn)在染色體高度重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)的異染色質(zhì)所在的部位。細(xì)胞遺傳標(biāo)記經(jīng)常伴有對(duì)生物有害的表型效應(yīng)，難以獲得相應(yīng)的標(biāo)記材料，或者觀測(cè)和鑒定比較困難，從而限制了細(xì)胞遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。443、生化與免疫遺傳標(biāo)記免疫遺傳學(xué)標(biāo)記(immunogenetical marker) 以動(dòng)物的免疫學(xué)特性為標(biāo)記，包括紅細(xì)胞抗原多態(tài)性和白細(xì)胞抗原多態(tài)性。生化遺傳標(biāo)記(biochemical genetic marker) 主要是指在同一動(dòng)物個(gè)體中具有相同功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體。45生化與免疫遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)與形態(tài)學(xué)標(biāo)識(shí)和細(xì)胞遺傳標(biāo)記相比，數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響更小

15、，檢測(cè)手段簡(jiǎn)便，是一種較好的遺傳標(biāo)記。血液型和蛋白質(zhì)型都是基因表達(dá)的產(chǎn)物，局限于反映基因組編碼區(qū)的遺傳信息，且標(biāo)記的數(shù)量還比較有限，不能很好地覆蓋整個(gè)基因組。464、分子遺傳標(biāo)記 分子遺傳標(biāo)記(molecular genetic marker) 是一種新的以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記. 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相繼建立了RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多種分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，開(kāi)創(chuàng)了遺傳標(biāo)記研究的新階段。47分子遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)無(wú)表型效應(yīng)不受環(huán)境的限制和影響普遍存在于所有生物數(shù)量豐富48理想的分子遺傳標(biāo)記應(yīng)具備的特點(diǎn)遺傳多態(tài)性高;檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快捷，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化;遺傳共顯性，即在

16、分離群中能夠分離出等位基因的3種基因型。標(biāo)記遍布整個(gè)基因組； 準(zhǔn)確性，能正確反映動(dòng)物的真實(shí)遺傳，即標(biāo)記是經(jīng)濟(jì)性狀基因，還是與影響重要性的性狀連鎖。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好（便于數(shù)據(jù)交換）； 開(kāi)發(fā)成本和使用成本盡量低廉； 49二、分子遺傳標(biāo)記1、RFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 2、TRS：串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記3、SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性501、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 RFLPrestriction fragment length polymorphism最早應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳學(xué)研究的分子標(biāo)記技術(shù)51RFLP的原理利用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，形成大小不等、數(shù)量不同的分子片段，經(jīng)電泳分離，通過(guò)Southern印跡

17、將DNA片段轉(zhuǎn)移至支持膜 (尼龍膜或硝酸纖維素膜)上，然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高辛，熒光素)標(biāo)記的探針與支持膜上的DNA片段進(jìn)行雜交。不同基因組DNA酶切位點(diǎn)的改變，會(huì)使得RFLP譜帶表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性.52RFLP示意圖限制性片段的制備電泳Southern 印 跡與放射性探針雜交放射性自顯影53RFLP的特點(diǎn)呈共顯性遺傳、無(wú)表型效應(yīng)、不受年齡性別的影響等優(yōu)點(diǎn)。分析一次只能檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)信息含量較低，而且操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，成本高，并且對(duì)模板DNA需求量大。54PCRRFLP將PCR技術(shù)用于RFLP分析，即PCR-RFLP。該技術(shù)先用1對(duì)引物特異性擴(kuò)增基因組的某一

18、高變區(qū)，然后用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，電泳檢測(cè)多態(tài)性。PCR-RFLP分析省去了探針的制備、分子雜交等繁瑣的過(guò)程，DNA需求量也少，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)。55PCRRFLP的應(yīng)用 CCT GAG GAG CCT GTG GAG CCT GAG GAG CCT GAG GAG CCT GTG GAG CCT GTG GAG Mst酶切位點(diǎn)Mst酶切位點(diǎn)消失PCR-RFLPProValGluProGluGlu1 2 3正常雜合異常56 2、串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記tandem repeated sequence,TRS真核生物基因組中的可變串聯(lián)重復(fù)序列 （variable number tan

19、dem repeated sequence, VNTR）有兩類:小衛(wèi)星和微衛(wèi)星，兩者具有高度的變異性。57(1) 小衛(wèi)星 (minisatellite DNA)小衛(wèi)星重復(fù)單位的核心序列為15一76bp近緣物種和個(gè)體間的小衛(wèi)星核心序列有著一定的同源性，在一定的條件下可以相互雜交。58DNA指紋圖譜原理選擇在VNTR特異序列上沒(méi)有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶將動(dòng)物總基因組DNA切成不同長(zhǎng)度的片段以VNTR中特異序列作為探針，進(jìn)行Southern雜交，由于不同個(gè)體的串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目和位置不同，形成的雜交譜帶具有個(gè)體的特異性，人們稱為DNA指紋圖譜 (DNA fingerprinting, DFP)59VNTR示意圖1 2 3ABC123VNTR變異的原理示意圖6061DFP的特點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)率高，位點(diǎn)呈共顯性遺傳個(gè)體具有高度特異性技術(shù)復(fù)雜、成本高，有時(shí)譜帶過(guò)于復(fù)雜62微衛(wèi)星（microsatellite DNA, MS)又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat,SSR)是高度重復(fù)序列，廣泛存在于真核生物基因組，重復(fù)單位的核心序列為26bp。63微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的原理以微衛(wèi)星DNA標(biāo)記兩側(cè)特異性序列設(shè)計(jì)專一引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)