生物物理學(xué)作業(yè)-lc3b蛋白依賴性免疫

1、Reporter: Rui ZhangDate: Nov.5,2015一、背景二、實驗思路三、結(jié)論背景關(guān)于RSV感染病STAT信號通路實驗思路1.LC3b-/-缺失加重RSV誘發(fā)的IL-17a依賴性肺炎12.RSV感染后，LC3b-/-CD11+ DCs 對自噬、固有細胞因子 的產(chǎn)生與 CD4+T細胞誘導(dǎo)發(fā)生了改變23. LC3b 蛋白的缺失導(dǎo)致Th17相關(guān)的RSV誘發(fā)的肺炎加重是 通過上皮細胞分泌的IL-1介導(dǎo)圖4a-g4.ER壓力的改變，導(dǎo)致缺失LC3b的小鼠支氣管上皮細胞加 重炎癥和細胞因子的產(chǎn)生圖5a-g5.在LC3b-/-小鼠中 阻斷IL-1受體信號可以減緩IL-17a相關(guān)疾病圖6a

2、-e實驗思路1-1. LC3b-/-缺失加重RSV誘發(fā)的IL-17a依賴性肺炎圖1a-h1-2. 確定在LC3b-/-小鼠中是否為CD4+T細胞主要分泌 IL-17圖1i-j1-3. 檢測是否在RSV感染的LC3b-/-小鼠中誘發(fā)的肺炎是 IL-17依賴性的圖2a-e 1.在RSV誘發(fā)的IL-17a依賴性肺炎中，若LC3b-/-缺失，小鼠的 病情將更加嚴重 特征： 支氣管上皮細胞脫落 粘液分泌過多 中性粒細胞增多Figure 1 LC3b-/-缺失的小鼠將加重由RSV誘發(fā)的肺炎a 對肺切片進行H & E,H & PAS染色b 與粘液相關(guān)的muc5ac與gob5轉(zhuǎn)錄本增多（qPCR）qPCRc

3、RSV病毒轉(zhuǎn)錄本增多（qPCR）用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/-8天后，d 中性粒細胞增多（流式）e IL-17a蛋白增多（使用Bioplex assay）f IFN轉(zhuǎn)錄本減少（qPCR）1a用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/-8天后，3ag 用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/-8天后，IL-1與IL-6蛋白含量上升（使用Bioplex assay）h 用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/- 48h后， IL-17a蛋白增多（使用Bioplex assay）1-2 1-2.確定在LC3b-/-小鼠中哪種細胞類型增強了IL-17的分泌水平 最近對IL-17依賴性疾病模型的研究表明，在IL-1受體信號通路中-T

4、細胞受體陽性細胞與固有淋巴細胞產(chǎn)生了大量的IL-17a蛋白。i 檢測肺中CD4+T細胞，CD3+T細胞與ILC3s細胞的數(shù)量（流式）j 檢測縱膈淋巴結(jié)（MedLNs)中CD4+T細胞，CD3+T細胞的數(shù)量1-21-3.檢測是否在RSV感染的LC3b-/-小鼠中誘發(fā)的肺炎是IL-17依賴性的 之前我們實驗室的研究發(fā)現(xiàn)在RSV感染后，本由IL-17a導(dǎo)致的肺炎，過多的粘液分泌與IFN分泌的抑制也被CD8+T細胞誘導(dǎo)。Figure 2 用IL-17a抗體中和證明在RSV感染的LC3b-/-小鼠中誘發(fā)的肺炎是IL-17依賴性的a RSV感染8天后，肺組織切片進行H & E,H & PAS染色，表明加入

5、IL-17a抗體后，炎癥減弱b 由抗體中和后，與粘液相關(guān)的muc5ac轉(zhuǎn)錄本減少（qPCR）c 由抗體中和后，中性粒細胞增多（流式） d 由抗體中和后，RSV病毒轉(zhuǎn)錄本減少（qPCR）e 由抗體中和后，IFN轉(zhuǎn)錄本增加（qPCR）2實驗思路2-1. RSV感染后，LC3b-/-CD11+ DCs 對自噬、固有細胞 因子的產(chǎn)生與 CD4+T細胞誘導(dǎo)發(fā)生了改變圖3a-f2-2. RSV感染后，確定是否DCs優(yōu)先誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌 IL-17a圖3j2-3. 進一步確定LC3b-/-DCs 誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌IL-17a 是自噬缺失的結(jié)果圖3h-i 2-1.RSV感染后，自噬與固有細胞因子的

6、產(chǎn)生發(fā)生了改變，由 LC3b-/-CD11+ DCs對 CD4+T細胞誘導(dǎo)也發(fā)生了改變 研究表明在Th17免疫反應(yīng)中需要CD11chigh CD11b+組織駐留DCs細胞，自噬的改變導(dǎo)致DCs與巨噬細胞接收TLR競爭者信號分泌IL-23DC細胞對炎癥的兩種反應(yīng)途徑Figure 3 RSV感染后，自噬與固有細胞因子的產(chǎn)生改變，由 LC3b-/- CD11+ DCs對 CD4+T細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17改變a LC3b-/- 小鼠與自噬相關(guān)的炎癥小體明顯降解（熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察 結(jié)論b 8h后，LC3b-/-p62保持積累（western分析）c IL-1，IL-6明顯上升 （流式分析）d

7、感染24h后，IL-12的亞基p35與p40明顯減少，IL-23明顯上升（流式） e IL-1與IL-6上升（使用Bioplex assay）f 感染24h后，IL-12的亞基p35與p40轉(zhuǎn)錄本明顯減少2-2g IL-17a升高（使用Bioplex assay）h 用OVA與RSV共處理，LC3b-/-DCs產(chǎn)生更高的 IL-17ai 用OVA與RSV共處理，LC3b-/-CD11b+DCs產(chǎn)生更高 的IL-17a4 3. LC3b 蛋白的缺失導(dǎo)致Th17相關(guān)的RSV誘發(fā)的肺炎加重是通過上皮細胞分泌的IL-1介導(dǎo) 由于上皮細胞中分泌的LC3b是一種重要的肺炎調(diào)節(jié)器，檢測結(jié)構(gòu)與骨髓干細胞在RS

8、V誘導(dǎo)的肺炎中的作用Figure 4 結(jié)構(gòu)與骨髓干細胞LC3b的缺乏都會加重RSV誘發(fā)的肺炎a-c 說明嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠細胞炎癥最嚴重，中性粒細胞與IL-17a蛋白分泌最多d RSV體外再刺激MedLN（縱膈淋巴結(jié)）48h后，IL-17a含量升高e 嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠細胞分泌的IFN最少f LC3b-/-型小鼠IL-6明顯分泌增多g 嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠細胞分泌的IL-1最多 4.ER壓力的改變，導(dǎo)致缺失LC3b的支氣管上皮細胞加重了炎癥和細胞因子的產(chǎn)生 進一步檢測在RSV感染中參與的先天性細胞因子。Figure 5 在RSV感染后由LC3b-/-型氣

9、管上皮細胞與肺巨噬細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子增加a 免疫組化分析說明IL-1是由上皮細胞產(chǎn)生的（IL-1抗體與E-Cadherin抗體處理）b IL-1與IL-1轉(zhuǎn)錄本升高c IL-1與IL-6含量上升（使用Bioplex assay）d 含肺巨噬細胞IL-1細胞數(shù)量上升（流式分析）e ER壓力相關(guān)基因CHOP,Edem-1 與cleaved XBP-1 (XBP-1s)的轉(zhuǎn)錄水平升高f 加入IRE-1a（ER壓力傳感器蛋白）抑制劑DBSA，IL-1與IL-6減少（使用Bioplex assay）g 與IL-1剪切有關(guān)的Caspase-1的p10亞基的檢測，加入DBSA后明顯減少45.在LC3b-/-小鼠中 阻斷IL-1受體信號可以減緩IL-17a相關(guān)疾病 LC3b-/- 小鼠中，檢測IL-1的過表達是否為促Th17分泌的原因。Figure 6 RSV感染后 LC3b-/-小鼠后，由于IL-1受體信號的阻斷，加重的IL-17a依賴性肺炎減輕 a IL-1Ra（IL-1受體拮抗劑）處理后，肺組織切片進行H & E,H & PAS染色， 炎癥明顯減輕 IL-1Ra（IL-1受