（精品）重組蛋白純化基本策略

1、重組蛋白純化基本策略捕獲階段：目標(biāo)是澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白。中度純化階段：目標(biāo) 是除去大多數(shù)大量雜質(zhì)，如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。精制階段： 除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。分離方法的選擇根據(jù)蛋白質(zhì)的特 殊性質(zhì)采用不同的分離方法：蛋白質(zhì)的性質(zhì)方法電荷(等電點(diǎn))離子交換 (IE 某)分子量凝膠過(guò)濾(GF)疏水性疏水(HIC)反相(RPC)特異性 結(jié)合親和(AC)每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平 衡。分辨率：由選擇的方法和層析介質(zhì)生成窄峰的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)?？偟膩?lái)說(shuō)， 當(dāng)雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白性質(zhì)相似時(shí)，在純化的最后階段分辨率是重要因素。處 理量：一般指在純化過(guò)程中目標(biāo)蛋白的上樣量

2、。如上樣體積、濃度等。速 度：在初純化中是重要因素，此時(shí)雜質(zhì)如蛋白酶必須盡快除去?；厥章剩?隨著純化的進(jìn)行漸趨重要，因?yàn)榧兓a(chǎn)物的價(jià)值在增加。在三階段純化策 略中每一種方法的適用性見(jiàn)下表：技術(shù)主要特點(diǎn)捕獲中度純化精制樣品起 始狀態(tài)樣品最終狀態(tài) IE 某高分辨率高容量高速度低離子強(qiáng)度樣品體積不 限高離子強(qiáng)度或 pH 改變。樣品濃縮 HIC 分辨率好容量好高速度高離子強(qiáng) 度樣品體積不限低離子強(qiáng)度樣品濃縮 AC 高分辨率高容量高速度結(jié)合條件 特殊樣品體積不限洗脫條件特殊樣品濃縮 GF 高分辨率(使用Supede 某) 樣品體積(蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)特性與分離純化技術(shù)的選擇摘要：蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四

3、級(jí)結(jié)構(gòu)決定了它的物理、化學(xué)、 生物化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，綜述了不同蛋白質(zhì)之間的性質(zhì)存在差 異或者改變條件是使之具有差異，利用一種同時(shí)多種性質(zhì)差異，在兼顧收 率和純度的情況下，選擇蛋白質(zhì)提純的方法。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)分離純化前言：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型 的細(xì)胞都含有成千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨 而繁重的任務(wù)，到目前為止，還沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法能把任 何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來(lái)，但對(duì)任何一種蛋白質(zhì)都有可能 選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x提純程序來(lái)獲取高純度的制品。蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)是設(shè)法增加制品純度或比活性，對(duì)純化的要求是 以

4、合理的效率、速度、收率和純度，將需要蛋白質(zhì)從細(xì)胞的全部其他成分 特別是不想要的雜蛋白中分離出來(lái)，同時(shí)仍保留有這種多肽的生物學(xué)活性 和化學(xué)完整性。能從成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)的原因，是不同的 蛋白質(zhì)在它們的許多物理、化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)有著極大的不同， 這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸的序列和數(shù)目不同造成的，連接在多肽主 鏈上氨基酸殘基可是荷正電的、荷負(fù)電的、極性的或非極性的、親水的或 疏水的，此外多肽可折疊成非常確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)( 螺旋、 折疊和各 種轉(zhuǎn)角)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，形成獨(dú)特的大小、形狀和殘基在蛋白質(zhì) 表面的分布狀況，利用待分離的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)的差異，

5、 即能設(shè)計(jì)出一組合理的分級(jí)分離步驟?？梢罁?jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)與之相對(duì)應(yīng) 的方法將蛋白質(zhì)混合物分離： 1分子大小不同種類的蛋白質(zhì)在分子大小方面有一定的差別，可用一些簡(jiǎn)便的方 法，使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。 11 透析和超濾透析在純化中極為常用，可除去鹽類(脫鹽及置換緩沖液)、有機(jī)溶 劑、低分子量的抑制劑等。透析膜的截留分子量為 5000 左右，如分子量 小于 10000 的酶液就有泄露的危險(xiǎn)，在純化中極為常用，可除去鹽類、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色 12 離心分離 置換緩沖液許多酶富集于某一細(xì)胞器內(nèi)，勻漿后離心得得到某一亞細(xì)胞成分，使 酶富集 1020 倍，再對(duì)特定的酶進(jìn)

6、行純化。差速離心，分辨率較低，僅適 用于粗提或濃縮。速率區(qū)帶法，如離心時(shí)間太長(zhǎng)所有的物質(zhì)都會(huì)沉淀下來(lái)， 故需選擇最佳分離時(shí)間，可得到相當(dāng)純的亞細(xì)胞成分用于進(jìn)一步純化，避 免了差速離心中大小組分一起沉淀的問(wèn)題，但容量較小，只能用于少量制 備。等密度梯度離心常用的離主介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀、 碘化鈉等等 13 凝膠過(guò)濾這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一，注意使要離 的蛋白質(zhì)分子量落在凝膠的工作范圍內(nèi)。選擇不同的分子量凝膠可用于脫 鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異除去熱源。 2形狀蛋白質(zhì)在離心通過(guò)溶液運(yùn)動(dòng)時(shí)，或通過(guò)膜、凝膠過(guò)濾填料顆?；螂娪?凝膠中的小孔運(yùn)動(dòng)時(shí)，都會(huì)受到形狀

7、的影響：對(duì)兩種相同質(zhì)量的蛋白質(zhì)而 言，球狀蛋白質(zhì)具有較小的有效半徑(斯托克半徑)，通過(guò)溶液沉降時(shí)遇 到的摩擦力小，沉降較快而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)大；反之，在體積排 阻色譜時(shí)，斯托克半徑較小的球狀蛋白質(zhì)更容易擴(kuò)散進(jìn)入凝膠過(guò)濾填料顆 粒內(nèi)部，較遲洗脫出來(lái)，因而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)要小。 3溶解度利用蛋白質(zhì)的溶解度的差別來(lái)分別各種蛋白質(zhì)常用的方法。影響蛋白 質(zhì)溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的 pH、離子強(qiáng)度、介電常 數(shù)和溫度，但在同一的特定外界條件下，不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。 適當(dāng)改變外界條件，控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度 31pH 控制 和等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)一般較不

8、易溶解。 32 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析 33 有機(jī)溶劑分級(jí)法蛋白質(zhì)在不同的溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶( 10g/ml)直至極易溶解(300mg/ml)不等。影響蛋白質(zhì)溶解度的可變 因素包括溫度、 pH、溶劑的極性、離子性質(zhì)和離子強(qiáng)度。引起蛋白質(zhì)沉淀 的有機(jī)溶劑的濃度不同，故控制有機(jī)溶劑的濃度可分離蛋白質(zhì)。水溶性非 離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質(zhì)的沉淀。 34 溫度不同的蛋白質(zhì)在不同的溫度具有不同的溶解度和活性。大多數(shù)蛋白質(zhì) 在低溫下比較穩(wěn)定，故分離操作一般在 0或更低溫度下進(jìn)行。 41 電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要手段，而且也是研 究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的方法。等電聚

9、焦分辨率很高， pI 有 0.02pH 的差異就能分開(kāi)。 2D-分離蛋白 質(zhì)分辨率已經(jīng)發(fā)展到 100000 個(gè)蛋白點(diǎn)。 42 離子交換層析改變蛋白質(zhì)混合物溶液中的鹽離子強(qiáng)度、 pH 和(陰、陽(yáng))離子交換 填料，不同蛋白質(zhì)對(duì)不同的離子交換填料的吸附容量不同，蛋白質(zhì)因吸附 容量不同或不被吸附而分離。洗脫可采用保持洗脫劑成分一直不變，也可采用改變洗脫劑的鹽度或 pH 的方法洗脫，后一種可分分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好， 分辨率高，特別是使用交換容量小，對(duì)鹽濃度敏感的離子交換劑，多用梯度洗脫?？刂葡疵搫┑捏w積(與柱床 體體積相比)、鹽濃度和 pH，樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來(lái)。蛋白分

10、子暴露在外表面的側(cè)鏈基團(tuán)的種類和數(shù)量不同，故在一定的 PH 值和離子強(qiáng)度的緩沖液的所帶的電荷不同 5電荷分布電荷的氨基酸殘基可均勻地分布于蛋白質(zhì)的表面，既可以適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度 與陽(yáng)離子交換柱結(jié)合也能以適當(dāng)強(qiáng)度與陰離子結(jié)合，因多數(shù)蛋白質(zhì)都有不 能在單一的溶劑條件下同時(shí)與兩種類型的離子交換柱結(jié)合，故可得用此性 質(zhì)純化；電荷的氨基酸殘基亦可成簇分布，使某一區(qū)域帶強(qiáng)正電荷而另一 區(qū)域帶強(qiáng)負(fù)電荷，呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性，只能在極端 pH 與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 或陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合，如鈣調(diào)蛋白只能在 pH2 時(shí)與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合。6疏水性多數(shù)疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，但也有一些在表面。蛋 白質(zhì)表面的疏水性氨基

11、酸殘基的數(shù)目和空間分布決定了該蛋白質(zhì)是否具有 與疏水柱填料結(jié)合從而利用它來(lái)進(jìn)行分離的能力。因其廉價(jià)和純化后的蛋白質(zhì)具有生物活性，是一種通用性的分離和純 化蛋白質(zhì)的工具。高濃度鹽水溶液中蛋白質(zhì)在柱上保留，在低鹽或水溶液 中蛋白質(zhì)從柱上被洗脫，故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以 及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直接進(jìn)樣到柱上，當(dāng)然也適用 7mol/鹽酸胍或 8mol/L 脲的大腸桿菌的治療蛋白質(zhì)提取液直接進(jìn)樣到柱上， 在分離的同時(shí)也進(jìn)行了復(fù)性。7密度多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在 1.31.4g/cm3 之間，分級(jí)分離蛋白質(zhì)時(shí)一般不 常用此性質(zhì)，不過(guò)對(duì)含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)與一般蛋白質(zhì)在密

12、度 上明顯不同，可用密度梯度法離心與大部分蛋白質(zhì)分離。8基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記通過(guò)改變 cDNA 在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個(gè)額外 氨基酸，這個(gè)加入的標(biāo)記可用來(lái)作為一個(gè)有效的純化依據(jù)。 81GST 融合 載體使要表達(dá)的蛋白質(zhì)和谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用 GlutathioneSepharoe4B 作親和純化，再利用凝血酶或因子某 a 切開(kāi)。82 蛋白 A 融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白 A 的 IgG 結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以 IgGSepharoe 純化。 83 含組氨酸標(biāo)記(Hitidine-tagged) ChelatingSepharoe最通行的標(biāo)記之一，是在

13、蛋白質(zhì)的氨基端加上 610 個(gè)組氨酸，在一 般或變性條件(如 8M 尿素)下借助它能與 Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力， 用咪唑洗脫，或?qū)?pH 降至 5.9 使組氨酸充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合 Ni2+使 之得以純化。重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或 可溶產(chǎn)物，擴(kuò)張床吸附技術(shù) STREAMLINE 適合做粗分離 9親和能力結(jié)合效率高，分離速度快的特點(diǎn)。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因 子、特異性的抗體、吸附后可改變緩沖液的離子強(qiáng)度和 PH 的方法，洗脫 下來(lái)，也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液洗脫親和層析固定相的配基與生物分子之間的特殊的生物大分子親和能力

14、 不同來(lái)進(jìn)行相互分離的，依親和選擇性的高低分為：基團(tuán)性親和層析，固 定相上的配基對(duì)一類基團(tuán)的極強(qiáng)的親和力。如含有糖基的一類蛋白質(zhì)或糖 蛋白對(duì)三嗪染料顯示特別強(qiáng)的吸附能力；高選擇性(專一性)親和層析， 配基僅對(duì)某一種蛋白質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性。如單克隆抗體對(duì)抗原的特異性的吸附。親和層析除特異性的吸附外，仍然會(huì)因分子的錯(cuò)誤認(rèn)別和分子間 非選擇性的作用力而吸附一些雜蛋白質(zhì)，另洗脫過(guò)程中的配體不可避免的 脫落進(jìn)入分離體系。與超濾結(jié)合起來(lái)，將兩者優(yōu)點(diǎn)集中形成超濾親和純化，具有高分離效 率和大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，適用于初分離。按配基的不同可分為：(1) 金屬螯合介質(zhì)過(guò)渡金屬離子 Cu2、 Zn2和 Ni2等以亞

15、胺絡(luò)合物的形式鍵合到因 定相上，由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成了配價(jià) 鍵，從而形成了亞胺金屬蛋白螯合物，使含有這些氨基酸的蛋白被這種 金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性受單個(gè)組氨酸和半胱氨 酸解離常數(shù)所控制，從而亦受流動(dòng)相的 pH 和溫度的影響，控制條件可以 使不同蛋白質(zhì)相互分離。(2)小配體親和介質(zhì)配體有精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)因子、明膠、肝素和賴氨酸等等。(3)抗體親和介質(zhì)即免疫親和層析，配體有重組蛋白 A 和重組蛋白G，但蛋白 A 比蛋白 G 專一，蛋白G 能結(jié)合更多不同源的 IgG。(4)顏料親和介質(zhì)染料層析的效果除主要取決于染料配基與酶的親和力大小外，還與

16、洗 脫緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、 PH 值及待分離的樣品的純度有關(guān)。配體有 CibacronBlue 和 ProcionRed 兩種。在一定的條件下，固定化的染料能起 陽(yáng)離子交換劑的作用，為了避免此現(xiàn)象的發(fā)生，最好要離子強(qiáng)度小于 0。1 和 PH 大于 7 時(shí)操作。(5)外源凝集素親和介質(zhì)配體有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素，固相外源凝 集素能和數(shù)種糖類殘基發(fā)生可逆反應(yīng)，適合純化多糖、糖蛋白。 10非極 性基團(tuán)之間作用力溶質(zhì)分子中的非極性基團(tuán)與非極性固定相間的相互作用力(非選擇性 分散力或倫敦力)大小與溶質(zhì)分子極性基團(tuán)與流動(dòng)力相中極性分子在相反 方向上相互作用力的差異進(jìn)行分離。因其流

17、動(dòng)相中的置換劑是極性小于水 的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈、四氫呋喃等)，這些有機(jī)溶劑可能使許多蛋 白質(zhì)分子產(chǎn)生不可逆的變性；流動(dòng)相中須有離子對(duì)試劑(如三氟乙酸、甲 酸、磷酸等)存在才可使分離有效地進(jìn)行和獲得高的質(zhì)量回收率；分離須 在酸性介質(zhì)中進(jìn)行(一般 pH 在23 之間)，又有一些蛋白質(zhì)會(huì)在后兩種 條件下產(chǎn)生不可逆的分子構(gòu)象變化，故在生物大分子中人分離純化中受到 限制，但分子構(gòu)象變化可逆的蛋白質(zhì)而言是有效的方法。正相色譜在生物 大分子中的分離和純化中應(yīng)用相對(duì)較少，因所用的溶劑很貴。 11可逆性 締合在某些溶液條件下，有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等，而在另一 種條件下則形成單體，如相繼在這兩種不

18、同的條件下按大小就可以進(jìn)行分 級(jí)分離。 12穩(wěn)定性 121 熱穩(wěn)定性大多數(shù)蛋白質(zhì)加熱到 95時(shí)會(huì)解折疊或沉淀，利用這一性質(zhì)，可容 易地將一種經(jīng)這樣加熱后仍保持其可溶性活性的蛋白質(zhì)從大部分其它細(xì)胞 蛋白質(zhì)中分離開(kāi)。 122 蛋白酶解穩(wěn)定性用蛋白酶處理上清液，消化雜蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白質(zhì)。13分配系數(shù)即利用雙水相萃取分離，常用的生物物質(zhì)分離體系有：聚乙二醇 (PEG) /葡聚糖(DE 某TRAN)、 PEG/磷酸鹽、 PEG/硫酸銨等。由于具有含水比例高、選用的聚合物及鹽對(duì)酶無(wú)毒性、分離設(shè)備與化學(xué)工業(yè)通用等 優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上目益受重視。分配行為受聚合物分子大小、成相濃度、 PH、無(wú)機(jī)鹽種類等因素影響， 發(fā)展：具有親和雙水相萃取及膜分離雙水相萃取等新型雙水相分離技術(shù)。 雙向水溶液系統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化一些與水混合多聚物的不相溶性導(dǎo)致依賴于多聚物濃度的兩相系統(tǒng)的 液-液分配技術(shù)，可以由兩不同的高水溶性的多聚物或一種多聚物各一種 鹽，用于從微生物勻漿中除支細(xì)胞碎片、后續(xù)分配步驟進(jìn)一步純化。分離 的選擇性一般隨著分離分子或顆粒大小面增加。 14表面活性 141 泡沫 分離蛋白質(zhì)溶液具有表面活性，氣體在溶液中鼓泡，氣泡與液相主體分離，