人淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制作實驗原理及步驟

1、實驗六人淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制作一、實驗?zāi)康模?學(xué)習(xí)動物細(xì)胞染色體標(biāo)本的制作方法，認(rèn)識染色體形態(tài)。二、實驗原理： 染色體是細(xì)胞遺傳的研究對象，分析認(rèn)識眼行為對于認(rèn)識遺傳物質(zhì)的傳遞、復(fù)制、畸變等都有重要的意義。獲得染色體的方法很多，目前對于哺乳動物比較常用的方法是外周血細(xì)胞培養(yǎng)法，就是將外周血接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培育，人類外周血細(xì)胞是終未分化細(xì)胞，一般沒有分裂能力，但經(jīng)PHA（植物血球凝集素）或ConA等藥物刺激后，轉(zhuǎn)變?yōu)榭煞至训霓D(zhuǎn)化細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入適量的秋水仙素，可使細(xì)胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細(xì)胞。用低滲鹽溶液（一般為0.4%KCl或0.075MKCl）處理，使其中的紅細(xì)胞及分裂

2、相細(xì)胞的膜破裂并使轉(zhuǎn)化細(xì)胞膨脹，結(jié)合離心技術(shù)，可將紅細(xì)胞碎片及分裂相細(xì)胞膜和一部分細(xì)胞質(zhì)除去，最后以氣干法制片，可獲得較好的染色體標(biāo)本。三、試劑和器材：（一）試劑：.培養(yǎng)基RPMI1640（或Eagles液）、胎牛血清、肝素、PHA、青鏈霉素、5%NaHCO3、2%碘酒、75%酒精、2g/ml秋水仙素（或10g/ml秋水仙胺）。低滲液：.KCl，預(yù)溫在37oC。固定液：甲醇、冰醋酸，每次在使用前按3：1臨時配制。染 液：2%Giemsa （二）器材： .超凈工作臺 .恒溫箱.5ml移液管 4.鏈霉素瓶100 ml血漿瓶 6.50 ml量筒1 ml，2 ml注射器 .清潔載片（使用前存冰箱中）9

3、.恒溫水浴（37oC） 10.水平離心機(jī)11.尖底離心管（10 ml） 12.天平13.試管架，定時鐘 14.吸管，橡皮頭15.相差顯微鏡 16.酒精燈（三）實驗材料： 人血 或 豬血四、實驗步驟：1.培養(yǎng)基的制備：在超凈工作臺上，用吸管吸取RPMI1640液10 ml，用1 ml注射器取肝素0.3 ml，PHA0.4 ml，青鏈霉素0.3 ml（各10000單位/ ml），混合均勻后用0.5%的NaHCO3，調(diào)整pH為7.0-7.2，然后用5 ml吸管分裝，每小瓶5 ml，用膠布封口。 .每小瓶接種全血.ml左右，在37oC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68-72小時，培養(yǎng)終止前6-7小時加2g/ml秋水仙素

4、2-3滴，使最終濃度為0.01-0.022g/ml。 .自培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)小瓶，用吸管將沉于瓶底的細(xì)胞沖散均勻，將細(xì)胞懸液移進(jìn)離心管中。 .平衡：將離心管置于已配平的天平上，通過加減離心管中細(xì)胞懸液來使天平重新配平。 .將離心管移入離心機(jī)的對稱套洞內(nèi)，蓋上離心機(jī)套，打開電源，待速度升到1500rpm時，離心8分鐘。 .用吸管小心移去上清液，留下細(xì)胞沉淀和上清液約1 ml，加入低滲液6.5 ml，吸打沉淀，使之混勻，置于37oC水浴10分鐘，同時按甲醇：冰醋酸=3：1比例配固定液20ml，盛于三角瓶中。 .預(yù)固定：加1ml新鮮配制的固定液，打勻細(xì)胞，立即以1000rpg離心10分鐘，移去上清夜。 .沿管壁緩慢加入5-6ml新固定液，用吸管輕輕打勻細(xì)胞團(tuán)塊。 .20分鐘后，以1000rpg離心5分鐘，去上清夜。 10.重復(fù)8-9步23次。 11.移去固定液，視細(xì)胞數(shù)量多少加入05-1ml新鮮固定液，將沉淀打成懸液。 12.在干凈、濕、冷的玻片上滴23滴細(xì)胞懸液，在酒精燈下略加烘烤，使其干燥。 13.在相差顯微鏡下觀察有無分裂相，如分裂相多，分散較好時，繼續(xù)做下列步驟，如不多且分散不好，則停止，如僅是分散不好，可以再固定一次。 14將玻片放下染色架上，每片加2ml-3ml ,2%Giemsa染液