乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法單增李斯特菌的檢驗(yàn)

1、乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法單增李斯特菌的檢驗(yàn) YLNB 4.61. 儀器及器材1.1 恒溫培養(yǎng)箱：301、2411.2 恒溫水浴鍋：461。1.3 顯微鏡：101001.4 離心機(jī)：4000 r/min1.5 均質(zhì)器或滅菌乳缽。1.6 滅菌平皿：直徑90mm。1.7 滅菌試管： 16mm160mm1.8 滅菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL刻度）。1.9 冰箱：041.10 錐形瓶：100mL、500mL。1.11 架盤藥物天平：0g500g,精確至0.5g。1.12 離心管：30mm300mm。1.13 滅菌注射器：11.14 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)株。1

2、.15 馬紅球菌。1.16 小白鼠：16g18g。2. 培養(yǎng)基和試劑 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉湯(TSBYE)：見附錄A1。 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆瓊脂(TSAYE)：見附錄A2。 EB增菌液：見附錄A3。2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：見附錄A4。2.5 三糖鐵(TSI)瓊脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。2.6 SIM動(dòng)力培養(yǎng)基：見附錄A5。2.7 血瓊脂：GB/T4789.28中4.6。2.8 改良的Mc Bride(MMA)瓊脂：見附錄A5。2.9 硝酸鹽培養(yǎng)基：GB/T 4789.28中3.17。2.10 緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和VP試驗(yàn)用)：GB/

3、T4789.28中3.4。2.11 糖發(fā)酵培養(yǎng)基：GB/T4789.28中3.2。2.12 過氧化氫酶試驗(yàn)：GB/T4789.28中4.38。2.13 鹽酸吖啶黃(AcriflavineHCl)(Sigma)。2.14 萘啶酮酸鈉鹽(Naladixicacid)(Sigma)。3. 檢驗(yàn)程序單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)程序如下：檢樣25g(ml)LB1增菌液225mlEB增菌液225ml30,48h 30,24hLB2增菌液225ml30,24h 選擇性培養(yǎng)基(MMA)30,2448h TSI瓊脂SIM動(dòng)力培養(yǎng)基25 2d5d(傘狀) 30,24hTSA-YE培養(yǎng)基30,24h 溶血實(shí)驗(yàn)MR-V

4、P實(shí)驗(yàn)小鼠致病力實(shí)驗(yàn)協(xié)同溶血實(shí)驗(yàn)革蘭氏染色顯微鏡下觀察運(yùn)動(dòng)硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)甘露醇七葉苷鼠李糖木醇 4. 方法4.1 樣品的收集及處理無菌取樣品25g(mL)放滅菌均質(zhì)器中加225mLEB和LB增菌液中，充分?jǐn)嚢璩删|(zhì)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，可暫存4冰箱。4.2 增菌培養(yǎng)EB增菌液放301培養(yǎng)48h，LB1增菌液225mL放301，培養(yǎng)24h，吸取0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。4.3 分離培養(yǎng)將EB增菌液和LB2二次增菌液分離于選擇培養(yǎng)基MMA瓊脂平板上，培養(yǎng)301 48h，挑選可疑菌落，用白熾燈45角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落為灰藍(lán)或藍(lán)色，小的圓形的菌落。4.4

5、選5個(gè)以上的上述可疑菌落接種三糖鐵(TSI)瓊脂和SIM動(dòng)力培養(yǎng)基，培養(yǎng)于251，觀察是否有動(dòng)力，且成傘狀或月芽狀生長(zhǎng)。一般觀察27d，陽(yáng)性者可做下一步鑒定。4.5 純培養(yǎng)將上述有動(dòng)力、形成傘狀者并在三糖鐵瓊脂培基上層、下層的產(chǎn)酸而不產(chǎn)硫化氫的可疑培養(yǎng)物接種于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSAYE)上，做純培養(yǎng)供做以下鑒定。4.6 染色鏡檢將上述可疑純培養(yǎng)物做革蘭氏染色并做濕片檢查；李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性小桿菌，大小為0.40.5m0.52.0m；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。4.7 生化特性將上述可疑菌做進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主

6、要生化特性及有關(guān)菌的區(qū)別見表1。表1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化性狀與有關(guān)菌的區(qū)別菌種溶血反應(yīng) 硝酸鹽還原 尿素酶 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七葉苷單核細(xì)胞增生李斯特氏菌+ - - +/+ - + - +綿羊李斯特氏菌+ - - +/+ - - - +英諾克李斯特氏菌 - - - +/+ - V - +威爾斯李斯特氏菌 - - - +/+ - V + +西爾李斯特氏菌 + - - +/+ - - + +格式李斯特氏菌 - - - +/+ + - - +默氏李斯特氏菌 - + - +/+ + V - +注：V反應(yīng)不定；+陽(yáng)性；-陰性。4.8 對(duì)小鼠的致病力試驗(yàn)將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于

7、TSBYE中，在30培養(yǎng)24h，離心，濃縮，使?jié)饪s液每毫升1010/mL個(gè)細(xì)菌，取0.5mL濃縮菌液注射小白鼠腹腔，35只，觀察小鼠死亡情況。致病株于25d內(nèi)死亡。試驗(yàn)時(shí)可用已知菌作對(duì)照。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌對(duì)小鼠有致病性。4.9 協(xié)同溶血試驗(yàn)(cAMP)在血平板上平行接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌(R.equi)，在它們中間垂直接種可疑李斯特氏菌，但不要觸及它們，在30培養(yǎng)2448h，檢查平板中垂直接種點(diǎn)對(duì)溶血環(huán)的影響。靠近金黃色葡萄球菌接種點(diǎn)的單核細(xì)胞增生李斯特菌的溶血增強(qiáng)，西爾李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)，而綿羊李斯特氏菌在馬紅球菌附近的溶血增強(qiáng)，有助于鑒別。附錄A 培養(yǎng)基(補(bǔ)

8、充件)A1含0.6%酵母漫膏的胰酪胨大豆肉湯(TSBYE)A1.1成分胰胨17g多價(jià)胨3g酵母膏6g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g 蒸餾水1000mLA1.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)至pH7.27.4，分裝，121滅菌15min，備用。A2含0.6%酵母膏胰酪胨大豆瓊脂(TSAYE)A2.1成分胰胨17g多價(jià)胨3g酵母膏6g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g瓊脂15g蒸餾水1000mLA2.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)pH至7.27.4，分裝，121高壓滅菌,備用。A3EB增菌液A3.1成分胰胨17g多價(jià)胨3g酵母膏6g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5

9、g蒸餾水1000mL鹽酸吖啶黃15mg/L萘啶酮酸40mg/LA3.2制法除吖啶黃和萘啶酮酸外，其余成分加熱混合調(diào)pH至7.27.4，12115min高壓滅菌。使用前加吖啶黃溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此兩種成分要無菌配制或過濾除菌。A4李氏增菌肉湯(LB1，LB2)A4.1 成分胰胨5g多價(jià)胨5g酵母膏5g氯化鈉5g磷酸二氫鉀1.35g磷酸氫二鈉12g七葉苷1g蒸餾水1000mLA4.2制法將上述成分加熱溶解，調(diào)pH至7.27.4，分裝，12115min高壓滅菌。A4.2.1李氏I液(LB1)225mL中加入：1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制) 0.45mL1%吖啶黃(用滅菌蒸餾水配制)0.27mLA4.2.2李氏液(LB2)200mL中加入：1%萘啶酮酸 0.40mL1%吖啶黃 0.50mL無菌分裝于10mL大試管中。A5改良的Mc Bride瓊脂(MMA)A5.1成分胰胨5g多價(jià)胨5g牛肉膏3g葡萄糖1g氯化鈉5g磷酸氫二鈉1g苯乙醇2.5mL無水甘氨酸10g氯化鋰0.5g瓊脂15g蒸餾水1000mL