《畢業(yè)設(shè)計－用紫外光譜分析測定飲料中咖啡因的含量》

1、 酒 泉 職 業(yè) 技 術(shù) 學(xué) 院 畢 業(yè)設(shè)計（論 文） 0 9 級 石油化工生產(chǎn)技術(shù) 專業(yè)題 目： 用紫外光譜分析測定飲 料中咖啡因的含量 畢業(yè)時間： 2012屆畢業(yè)生 學(xué)生姓名： 指導(dǎo)教師： 班 級： 09石化（1）班 2011 年 3月5日酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院 2 0 1 2 屆各專業(yè)畢業(yè)論文（設(shè)計）成績評定表姓名屈永德班級09石化（1）班專業(yè)石油化工生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)教師第一次指導(dǎo)意見 論文內(nèi)容基本符合要求，在第一章中將紫外分光光度計的組成融合到儀器構(gòu)成當(dāng)中；表格需注明序號及標(biāo)題，置于表格上方居中；插圖注明序號及標(biāo)題，置于插圖下方居中；將出現(xiàn)的公式用公式編輯器寫規(guī)范；將剪切過來的表格全部畫出來；另

2、外注意文章排版按照學(xué)校要求的，其次，使文章內(nèi)容連貫得體。 2011年5月25日指導(dǎo)教師第二次指導(dǎo)意見 論文符合要求，但要注意論文中的標(biāo)點符號的正確應(yīng)用；其次論文在排版上要多下功夫，將第一章中的紫外風(fēng)光光度法的應(yīng)用分四部分寫，先寫定量，再寫定性，最后寫再其它方面的應(yīng)用，論文中的公式要重新編寫，認(rèn)真的讀論文，要善于發(fā)現(xiàn)里面的錯別字，修改錯別字。 2011年6月2日指導(dǎo)教師第三次指導(dǎo)意見指導(dǎo)教師評語及評分 成績： 簽字（蓋章） 年 月 日答辯小組評價意見及評分 成績： 簽字（蓋章） 年 月 日教學(xué)系畢業(yè)實踐環(huán)節(jié)指導(dǎo)小組意見簽字（蓋章） 年 月 日學(xué)院畢業(yè)實踐環(huán)節(jié)指導(dǎo)委員會審核意見簽字（蓋章） 年 月

3、 日說明：1、以上各欄必須按要求逐項填寫.。2、此表附于畢業(yè)論文 (設(shè)計)封面之后。目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc972 前言 PAGEREF _Toc972 6 HYPERLINK l _Toc15066 一 紫外可見分光光度計概述 PAGEREF _Toc15066 7 HYPERLINK l _Toc15711 （一） 分光光度法原理 PAGEREF _Toc15711 7 HYPERLINK l _Toc23409 （二） 分光光度儀構(gòu)成 PAGEREF _Toc23409 8 HYPERLINK l _Toc24547 1 輻射源 PAGERE

4、F _Toc24547 8 HYPERLINK l _Toc19458 2 進(jìn)樣裝置單色器 PAGEREF _Toc19458 8 HYPERLINK l _Toc30834 3 光源 PAGEREF _Toc30834 9 HYPERLINK l _Toc18725 4 反應(yīng)池（吸收池） PAGEREF _Toc18725 9 HYPERLINK l _Toc7096 5 檢測系統(tǒng) PAGEREF _Toc7096 9 HYPERLINK l _Toc16879 （三） 紫外可見分光光度法特點 PAGEREF _Toc16879 9 HYPERLINK l _Toc18143 1 應(yīng)用廣泛

5、PAGEREF _Toc18143 9 HYPERLINK l _Toc30672 2 靈敏度高 PAGEREF _Toc30672 10 HYPERLINK l _Toc31253 3 選擇性好 PAGEREF _Toc31253 10 HYPERLINK l _Toc32556 4 準(zhǔn)確度高 PAGEREF _Toc32556 10 HYPERLINK l _Toc10920 5 適用濃度范圍廣 PAGEREF _Toc10920 10 HYPERLINK l _Toc7327 6 分析成本低、操作簡便、快速 PAGEREF _Toc7327 10 HYPERLINK l _Toc1520

6、7 （四）紫外可見分光光度法的應(yīng)用 PAGEREF _Toc15207 10 HYPERLINK l _Toc19256 1 光譜分析 PAGEREF _Toc19256 10 HYPERLINK l _Toc14521 2 紫外可見分光光度法定性分析 PAGEREF _Toc14521 11 HYPERLINK l _Toc13578 3 紫外可見分光光度法定量分析物質(zhì)含量 PAGEREF _Toc13578 13 HYPERLINK l _Toc0 4 在其它方面的應(yīng)用 PAGEREF _Toc0 15 HYPERLINK l _Toc5695 二 紫外分光光度法測飲料中咖啡因的含量 PA

7、GEREF _Toc5695 16 HYPERLINK l _Toc9759 （一） 實驗藥品及儀器 PAGEREF _Toc9759 16 HYPERLINK l _Toc30360 1 藥品 PAGEREF _Toc30360 16 HYPERLINK l _Toc23827 2 儀器 PAGEREF _Toc23827 17 HYPERLINK l _Toc22876 （二） 實驗分析步驟 PAGEREF _Toc22876 17 HYPERLINK l _Toc28419 1 樣品的處理 PAGEREF _Toc28419 17 HYPERLINK l _Toc381 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪

8、制 PAGEREF _Toc381 18 HYPERLINK l _Toc23150 3 測定 PAGEREF _Toc23150 18 HYPERLINK l _Toc17707 （三） 實驗結(jié)果 PAGEREF _Toc17707 19 HYPERLINK l _Toc25383 1 計算 PAGEREF _Toc25383 19 HYPERLINK l _Toc5321 2 本實驗條件下 PAGEREF _Toc5321 19 HYPERLINK l _Toc10899 3 允許差 PAGEREF _Toc10899 20 HYPERLINK l _Toc16591 （四） 實驗條件的選

9、擇 PAGEREF _Toc16591 20 HYPERLINK l _Toc12350 1 吸收曲線 PAGEREF _Toc12350 20 HYPERLINK l _Toc24759 2 pH的影響 PAGEREF _Toc24759 20 HYPERLINK l _Toc21357 3 氯化鈉對方法的影響 PAGEREF _Toc21357 21 HYPERLINK l _Toc11676 4 萃取時間 PAGEREF _Toc11676 22 HYPERLINK l _Toc3084 5 提取溶劑的使用量 PAGEREF _Toc3084 22 HYPERLINK l _Toc240

10、46 6 方法精密度 PAGEREF _Toc24046 23 HYPERLINK l _Toc17442 （五） 結(jié)果與討論 PAGEREF _Toc17442 24 HYPERLINK l _Toc21418 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 PAGEREF _Toc21418 24 HYPERLINK l _Toc7578 2 咖啡因分析條件的優(yōu)化 PAGEREF _Toc7578 24 HYPERLINK l _Toc22883 致謝 PAGEREF _Toc22883 27 HYPERLINK l _Toc4007 參考文獻(xiàn) PAGEREF _Toc4007 28摘要 咖啡因廣泛應(yīng)用于當(dāng)今許多碳酸飲料和

11、能量飲料中。隨著可樂飲料如可口可樂，百事可樂等在全世界的風(fēng)靡，各種可樂飲料已經(jīng)成為人們飲食當(dāng)中攝取咖啡因次數(shù)較高的一個重要來源，但大量或長期攝取咖啡因有損人體的健康。因此,各國對飲料中咖啡因的含量都做出了相應(yīng)的規(guī)定和限制?，F(xiàn)有的咖啡因分析方法中，光譜分析方法簡單，直接，但很難避免樣品基質(zhì)和其它物質(zhì)的干擾，所得結(jié)果往往有較大誤差；色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法準(zhǔn)確、靈敏度高，但往往樣品前處理步驟繁瑣，需要使用大量的有機溶劑，分析時間較長，所需的分析費用也相對較高。因此，發(fā)展一種簡便、有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的分析方法用于飲料中咖啡因的日常質(zhì)量控制和法規(guī)檢測顯得尤為重要。 本論文采用紫外光譜分析方法測定飲料中

12、咖啡因的含量。該方法簡單快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏度高、干擾物排除能力強，同時也是對所學(xué)知識的一種鞏固運用。關(guān)鍵詞：紫外分光光譜法；飲料；咖啡因；測定； 前言 咖啡因(caffeine)又名咖啡堿，屬甲基黃嘌呤化合物，化學(xué)名稱為1，3，7三甲基黃嘌呤，為白色無臭味苦的發(fā)亮針絲狀或粉末結(jié)晶。熔點為 234 -238 ，178升華，能溶于乙醚、丙酮、氯仿、水，微溶于石油醚。以往咖啡因常采用容量法，因操作復(fù)雜不太理想。實踐證明本方法簡單快速好，可用于可樂型飲料中咖啡因的測定。 咖啡因具有提神醒腦等刺激中樞神經(jīng)作用，但易上癮。為此，各國制定了咖啡因在飲料中的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。美國、加拿大、阿根廷、日本、菲律賓

13、規(guī)定飲料中咖啡因的含量不得超過200mg/L，南斯拉夫規(guī)定不得超過120mg/L，到目前為止我國僅允許咖啡因加入到可樂型飲料中，其含量不得超過150mg/Kg，為了加強食品衛(wèi)生監(jiān)督管理，建立咖啡因的標(biāo)準(zhǔn)測定方法十分必要。 紫外分光光度法是可樂型飲料、咖啡和茶葉以及制成品中咖啡因含量的測定方法。其方法簡單、快速、準(zhǔn)確。最低檢出濃度：紫外法對可樂型飲料為3mg/L；對咖啡、茶葉及其固體制品為5mg/100g；對咖啡和茶葉的液體制品為5mg/L。一 紫外可見分光光度計概述（一） 分光光度法原理分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。 在分

14、光光度計中，將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強度。如以波長（）為橫坐標(biāo)，吸收強度（A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線。利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法；用可見光光源測定有色物質(zhì)的方法，稱為可見光光度法。它們與比色法一樣，都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ)。 上述的紫外光區(qū)與可見光區(qū)是常用的。但分光光度法的應(yīng)用光區(qū)包括紫外光區(qū)，可見光區(qū)，紅外光區(qū)。當(dāng)一束強度為I0的單色光垂直照射某物質(zhì)的溶液后,由于一部分光被體系吸收,因此透射光的強度降至I，則溶液

15、的透光率T為：I/I0根據(jù)朗伯（Lambert）-比爾（Beer）定律: A=abc 式中A為吸光度，b為溶液層厚度（cm），c為溶液的濃度（g/dm3）， a為吸光系數(shù)。其中吸光系數(shù)與溶液的本性、溫度以及波長等因素有關(guān)。溶液中其他組分（如溶劑等）對光的吸收可用空白液扣除。 由上式可知，當(dāng)固定溶液層厚度L和吸光系數(shù)時，吸光度A與溶液的濃度成線性關(guān)系。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜），從中確定最大吸收波長，然后以此波長的光為光源，測定一系列已知濃度c溶液的吸光度A，作出A-c工作曲線。在分析未知溶液時，根據(jù)測量的吸光度A，查工作曲線即可確定出相應(yīng)的濃度。這便是分光

16、光度法測量濃度的基本原理。上述方法是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法來求出未知濃度值，在滿足要求（準(zhǔn)確度和精密度）的條件下，可以應(yīng)用比較法求出未知濃度值。（二） 分光光度儀構(gòu)成 依據(jù)分光光度法測量原理，把比較法應(yīng)用到儀器之中濃度直讀功能。用標(biāo)準(zhǔn)溶液將儀器調(diào)整好，再測定樣品時，直接顯示樣品濃度值。1 輻射源自動檢測儀器的核心組成部分，通過運行檢測程序和鏈接顯示器以及其他外部設(shè)備，實現(xiàn)在線自動檢測、數(shù)據(jù)儲存于采集、遠(yuǎn)程控制等。輻射源必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長范圍3502500納米），氘燈或氫燈（180460納米），或可調(diào)諧染料激光光源等。2 進(jìn)樣裝置單色器蠕

17、動泵和九通閥實現(xiàn)多個反應(yīng)試劑及樣品的進(jìn)液，計量裝置控制反應(yīng)試劑及樣品進(jìn)樣量。單色器它由入射、出射狹縫、HYPERLINK :/ hudong /wiki/%E9%80%8F%E9%95%9C o 透鏡透鏡系統(tǒng)和色散元件（HYPERLINK :/ hudong /wiki/%E6%A3%B1%E9%95%9C o 棱鏡棱鏡或HYPERLINK :/ hudong /wiki/%E5%85%89%E6%A0%85 t _blank o 光柵光柵）組成，是用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復(fù)合光分解為單色光和分出所需的單色光束。3 光源發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強度，

18、穩(wěn)定。（穩(wěn)壓裝置）4 反應(yīng)池（吸收池） 檢測時的化學(xué)反應(yīng)均在反應(yīng)池內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后被測試液將由檢測系統(tǒng)將信號傳輸并分析。因此，反應(yīng)池有兩個作用：一是作為分光光度檢測的化學(xué)反應(yīng)裝置；二是作為分光光度檢測的比色皿。玻璃比色皿能吸收紫外光，僅適用于可見光區(qū)；石英比色皿不吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)。試樣容器，又稱吸收池，供盛放試液進(jìn)行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見區(qū)，后者只適用于可見區(qū)。容器的光程一般為0.510厘米。5 檢測系統(tǒng)將通過被測試液吸收后的光信號(強度)放大，并通過顯示器以數(shù)值形式顯示出來，該過程中應(yīng)該注意，由于隨機誤差原因，比較法準(zhǔn)確度相對于標(biāo)準(zhǔn)曲線

19、法要差一些，另外標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測溶液濃度相差太大時有較大誤差和顯色反應(yīng)與顯色條件。檢測器，又稱光電轉(zhuǎn)換器，常用的有HYPERLINK :/ hudong /wiki/%E5%85%89%E7%94%B5%E7%AE%A1 o 光電管光電管或HYPERLINK :/ hudong /wiki/%E5%85%89%E7%94%B5%E5%80%8D%E5%A2%9E%E7%AE%A1 t _blank o 光電倍增管光電倍增管，后者較前者更靈敏，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導(dǎo)攝像管或光電二極管矩陣作檢測器，具有快速掃描的特點。（三） 紫外可見分光光度法特點分光光度法對于分析人員來說，可以

20、說是最有用的工具之一。幾乎每一個分析實驗室都離不開紫外可見分光光度計。分光光度法的主要特點為：1 應(yīng)用廣泛由于各種各樣的無機物和有機物在紫外可見區(qū)都有吸收，因此均可借此法加以測定。到目前為止，幾乎化學(xué)元素周期表上的所有元素（除少數(shù)放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。2 靈敏度高由于相應(yīng)學(xué)科的發(fā)展，使新的有機顯色劑的合成和研究取得可喜的進(jìn)展，從而對元素測定的靈敏度大大提高了一步。特別是由于多元絡(luò)合物和各種表面活性劑的應(yīng)用研究，使許多元素的摩爾吸光系數(shù)由原來的幾萬提高到幾十萬。相對于其它痕量分析方法而言，光度法的精密度和準(zhǔn)確度一致公認(rèn)是比較高的。不但在實際工作中光度法被廣泛采用，在標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)

21、的研制中，它更受重視，很多光度分析法已制定成為標(biāo)準(zhǔn)方法。3 選擇性好目前已有些元素只要利用控制適當(dāng)?shù)娘@色條件就可直接進(jìn)行光度法測定，如鈷、鈾、鎳、銅、銀、鐵等元素的測定，已有比較滿意的方法了。4 準(zhǔn)確度高對于一般的分光光度法來說，其濃度測量的相對誤差在1-3%范圍內(nèi)，如采用示差分光度法測量，則誤差往往可減少到千分之幾。5 適用濃度范圍廣可從常量（1-50%）（尤其是使用示差法）到恒量（10-6-10-8%）（經(jīng)預(yù)富集后）6 分析成本低、操作簡便、快速（四）紫外可見分光光度法的應(yīng)用1 光譜分析有時候需要研究某物質(zhì)在某溶劑中的光譜特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和處有吸收波峰。 大多數(shù)情況

22、下，比色分析都提供了使用光的波長（一般是最大吸收峰波長）。如果沒有提供使用波長的話，可以用紫外分光光度計從2001000nm范圍內(nèi)掃描吸收光譜，搜索到吸收峰，再用吸收峰波長來比色分析。 咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標(biāo)準(zhǔn)品；下：樣品。圖1 咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量圖2 紫外可見分光光度法定性分析（1） 可作為物質(zhì)定性的參考被測物質(zhì)的光譜特性和標(biāo)準(zhǔn)物如果一致，可粗略定性。如檢查VB12注射液是否變質(zhì)，測定其光譜，結(jié)果為2790；0；個吸收峰，完全一致，可以判定該物質(zhì)為VB12（未變質(zhì)）。 表1 一些苯衍生物的紫外光譜特征如下表所示化合物 溶劑 吸收峰吸收峰 吸收峰 Emolmax，1

23、cm 苯 碳?xì)浠衔?254nm250 nm 204 nm 8800 nm 甲苯 碳?xì)浠衔?262 nm260 nm 208 nm 7900 nm 六甲基苯 碳?xì)浠衔?271 nm230 nm 221 nm 10000 nm 氯苯 碳?xì)浠衔?267 nm200 nm 210 nm 7400 nm 苯酚 碳?xì)浠衔?271 nm1260 nm 213 nm 6200 nm （2） 用于有機化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析紫外吸收光譜在某種程度上反映了化合物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，所以可以用于有機化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析。利用標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜可以對未知化合物進(jìn)行鑒定，即控制相同的測量條件，將未知化合物的吸收光譜

24、與標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對照，如果兩者吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、位置、最大吸收波長及吸光強度完全一致，則可說明它們分子結(jié)構(gòu)中存在相同的生色基團(tuán)，初步確定它們是同一種物質(zhì)，如咖啡因的定性。由于大多數(shù)有機化合物的紫外光譜比較簡單，缺乏精細(xì)的結(jié)構(gòu)特征，而且很多生色團(tuán)的吸收峰幾乎不受分子中其它非吸收基團(tuán)的影響，因此，僅根據(jù)紫外光譜鑒定有機化合物有很大局限，一般必須與紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜等相配合，才能進(jìn)行精確的鑒定。 在測定有機物的紫外可見吸收光譜時，在溶解度容許范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇非極性溶劑或極性較小的溶劑（烷、烯烴，如正己烷、正庚烷），以獲得吸收光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)。與標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比時

25、，必須用相同的溶劑。所選擇的溶劑在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)應(yīng)該沒有明顯的吸收；并且不含有其它干擾物質(zhì)；與溶質(zhì)沒有相互作用。否則會使光譜線產(chǎn)生移動，低于此波長時，溶劑的吸收不可忽略。表2 常用溶劑的波長范圍如下 溶 劑使 用 波 長 范 圍溶 劑使 用 波 長 范 圍甲 醇210二 氯 甲 烷 235 .乙 醇210氯 仿 235 .水210乙 酸 乙 酯 235 .96% 硫 酸210苯 235 .乙 醚210甲 苯 235 .3 紫外可見分光光度法定量分析物質(zhì)含量（1） 朗伯-比爾定律朗伯-比爾定律中的K稱為吸光系數(shù)。因比色杯的直徑用cm為單位，因此K的單位決定于濃度c用什么單位，如c以mol/L

26、為單位時K稱為摩爾吸光系數(shù)，用Emol或mol表示；如果物質(zhì)的分子量未知，濃度可用%為單位，K稱為百分吸光系數(shù)，用E%表示。 E的定義是：某波長光通過1cm杯、1mol/L或1%濃度的某溶液時，該溶液對該波長光的吸光度。E在特定波長、1mol/L或1%濃度、特定溶劑條件下是該物質(zhì)的一個特征常數(shù)，反映該物質(zhì)的吸光能力，資料和測定時都要標(biāo)明其特征波長或最大吸收波長，表示為或E%nm，max，1cm重新輸入。許多物質(zhì)的吸光系數(shù)在書或資料中可以查到，如藥典規(guī)定VB12應(yīng)該有2781 nm、3611nm、5502nm 3個吸收峰，其E1%361nm，1cm=207。實際工作中，1mol/L的濃度太高，可

27、以配成1mmol/L或1mol/L的濃度，相應(yīng)地寫成Emmol（mol）nm，max，1cm。（2) 紫外可見分光光度法定量分析根據(jù)吸光系數(shù)的特性 ，它有4項用途： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 檢查純度: 紫外光譜法檢查純度是一種簡便有效的方法，用于許多化合物檢測。如阿司匹林在空氣中容易吸收水分產(chǎn)生水楊酸，阿司匹林在280nm處有強吸收峰，而水楊酸的吸收峰遷移到312nm，只要檢測在312nm處是否有吸收峰，即可判斷有無水楊酸。再如無水乙醇精制過程中要用苯，測定無水乙醇中是否殘留苯，測定其吸收光譜，乙醇在210600nm之間無吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以純

28、無水乙醇為參比，對樣品進(jìn)行光譜分析，如果在250、254nm處出現(xiàn)吸收峰，則說明有苯殘留。 = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 檢查含量（純度）:如藥典規(guī)定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原標(biāo)示濃度為0.05%，求實際濃度，方法：藥液用重蒸水精確稀釋20倍，水做參比，用361nm測定的吸光度為0.512，其含量為：1%207=x%0.512 ，x%=0.00247%，濃度= 0.00247%20=0.049% = 3 * GB3 * MERGEFORMAT 應(yīng)用摩爾吸光系數(shù)測定濃度: 一般的比色分析中都有標(biāo)準(zhǔn)品，未知樣品都是通過和標(biāo)準(zhǔn)溶液對比分

29、析含量。某些情況下，沒有標(biāo)準(zhǔn)品，可以用摩爾吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)進(jìn)行測定，直接測定溶液的吸光度，通過和該純物質(zhì)的吸光系數(shù)比較，可以計算出濃度。這樣的分析需要經(jīng)過精確校正了波長的分光光度計，紫外分光光度計的波長一般精確到2nm，可以承擔(dān)這樣的分析。如果知道分子量的話，百分吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)之間可以互相換算，換算公式是：百分吸光系數(shù)=10摩爾吸光系數(shù)物質(zhì)的分子量。 比如血紅蛋白是4個亞基組成的蛋白質(zhì)，單個亞基的平均分子量是16114.5。每個亞基都在高鐵氰化鉀K3Fe(CN)6和氰化鉀KCN溶液中形成單體氰化高鐵血紅蛋白（HiCN），它的特征（最大）吸收峰在540nm處，摩爾吸光系數(shù)是1100

30、0，表示為Emolmax,540nm,HiCN=11000。 測定樣品在同樣條件下的吸光度，就可以計算出含量。如：將血液0.02ml加入到5.0ml氰化高鐵試劑中，用540nm測定的吸光度為0.35，求血液中Hb的含量（g/L）。第一步，計算血液稀釋倍數(shù)：5.020.02=251（倍）；第二步，計算：1mol11000=x mol0.35，x=0.3511000 mol/L，乘以分子量和稀釋倍數(shù)變?yōu)間， x=0.351100016114.5 251=128.7（g/L）。如果有些物質(zhì)不知分子量，用它的1%溶液在同樣條件下測定，用百分吸光系數(shù)同樣可以換算。 = 4 * GB3 * MERGEFO

31、RMAT 作為光度計使用：有色的反應(yīng)液可以用普通的分光光度計（721、722、濃度計），也可以用紫外分光光度計比色。某些溶液、反應(yīng)液無色，在200400nm之間有特征性光吸收，就只能用紫外分光光度計。 1. 單一物質(zhì)測定：先測定溶質(zhì)的吸收光譜，一般用最大吸收波長進(jìn)行比色。常用方法有2種: （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用標(biāo)準(zhǔn)液制作一系列標(biāo)準(zhǔn)管的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測定結(jié)果查標(biāo)準(zhǔn)曲線求知。 （2）對照管法：制作標(biāo)準(zhǔn)測定管和樣品測定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰）處測定吸光度進(jìn)行比較，可直接求出樣品含量。如VB12含量測定：精確吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀釋n倍，使每含的標(biāo)示量為30g/ml，另外配VB12標(biāo)

32、準(zhǔn)液濃度為30g/ml，蒸餾水調(diào)零，用361nm測定吸光度A，計算：測定液中VB12含量（g/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）30；注射液中VB12含量（g/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）30 n（稀釋倍數(shù)）V（取樣量，ml）。 2. 混合物中兩物質(zhì)同時測定（兩物質(zhì)的最大吸收峰有部分重合）， N NaOH中最大吸收峰為380nm，E1%1cm，max；在0.1N HCl中最大吸收峰為355nm，E1%1cm，max ；兩吸收峰都可以做為四環(huán)素的測定波長。但與金霉素共存時，因為金霉素在355nm處有吸收（金霉素在0.1N HCl中E1%1cm，max =182.6），只能用380nm測定四環(huán)素?；旌蠘?/p>

33、品在355nm處測定二者的總吸光度，在380nm處測得四環(huán)素的吸光度，則兩者的濃度都可以求出。測定方法： （1）測定1%混合物在0.1N HCl溶液的吸光度A335 （2）測定1%混合物在0.25N NaOH溶液的吸光度A380，計算：四環(huán)素濃度C1（g%）= AC1380 / E1%（C1）1cm，380= AC1380 / 372.0 金霉素濃度C2（g%）=AC1+C2335（E1%（C1）1cm，355 C1）E1%（C2）1cm，355 = AC1+C2335（303.2AC13804 在其它方面的應(yīng)用紫外光度法廣泛應(yīng)用在化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生檢驗分析方面。凡在20

34、0-1000nm范圍內(nèi)有特征性吸收，或與試劑反應(yīng)后形成特征性吸收，符合郎伯比爾定律的，都可以分析。如： (1) 測定蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸對280nm的紫外線有最大吸收，吸收值與其濃度成正比，樣品不必反應(yīng)，稀釋后直接測定。 (2) 肌紅蛋白：在576nm附近有吸收峰，不需要標(biāo)準(zhǔn)品，通過摩爾吸光系數(shù)法，可直接測定。 (3) 還原性谷胱甘肽：與四氧嘧啶反應(yīng)，生成物在305nm處有最大吸收峰。 (4) 過氧化氫酶：有可見光測定法，也有紫外法。 (5) 抗生素：大部分可用紫外法測定，如青霉素、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、金霉素、新生霉素。 (6) 許多藥物要用紫外光譜測定：如咖啡因用272.6

35、nm；巴比妥類（安眠藥）用220240nm測定；5種氯丙嗪類藥（鎮(zhèn)定藥）全用249307nm測定；安眠酮用235和503nm分析；安定（鎮(zhèn)靜藥）用240和285nm分析。 (7) 用于紫外比色測定：食品中硒與鄰苯二胺反應(yīng)，將絡(luò)合物提取到甲苯中，反應(yīng)物在335nm左右有吸收峰，用紫外比色測定。二 紫外分光光度法測飲料中咖啡因的含量（一） 實驗藥品及儀器1 藥品 本實驗所用試劑均為分析純試劑，實驗用水為蒸餾水。（本實驗所有試劑均由酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系實驗室提供）（1）無水硫酸鈉（2）三氯甲烷使用前重新蒸餾（3）(m/v)高錳酸鉀溶液: 稱取高錳酸鉀，用水溶解并稀釋至100mL。（4）亞硫酸鈉

36、和硫氰酸鉀混合溶液: 稱取10g無水亞硫酸鈉(Na2SO3)，用水溶解并稀釋至100mL，另取10g硫氰酸鉀，用水溶解并稀釋至100mL，然后二者均勻混合。（5）15%(V/V)磷酸溶液: 吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。（6）20%(m/V)氫氧化鈉溶液: 稱取20g氫氧化鈉，用水溶解，冷卻后稀釋至100mL。（7）20%(m/V)醋酸鋅溶液: 稱取20g醋酸鋅Zn(CH3COO)22H2O加入3mL冰乙酸，加水溶解并稀釋至100mL。（8）10%(m/V)亞鐵氰化鉀溶液: 稱取10g亞鐵氰化鉀。K4Fe(CN)63H2O用水溶解并稀釋至100mL。（9）咖啡因

37、標(biāo)準(zhǔn)品: 含量98.0%以上。（10）咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲備液: 根據(jù)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的含量用重蒸三氯甲烷配制成每mL相當(dāng)于0.5mg咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。2 儀器紫外分光光度計。（二） 實驗分析步驟1 樣品的處理（1） 飲料:在250mL的分液漏斗中，準(zhǔn)確移入10.0mL經(jīng)超聲脫氣后的均勻可樂型飲料試樣，加入1.5%高錳酸鉀溶液5mL，搖勻，靜置于5min，加入混合溶液10mL，搖勻，加入30mL重蒸三氯甲烷。振搖100鎰，靜止分層，收集三氯甲烷。水層再加入10mL重蒸三氯甲烷，振搖100次，靜置分層。合并二次三氯甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至100mL，搖勻，備用。（2） 咖啡、茶葉及其固

38、體制成品:在100mL燒杯中稱取經(jīng)粉碎成低于30目的均勻樣品0.52.0g:1:1操作進(jìn)行，制備成100mL三氯甲烷溶液，備用。（3）咖啡或茶葉的液體制成品：在1:1:1操作進(jìn)行，制備成100mL三氯甲烷溶液，備用。2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 從0.5mg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲備液中，用重蒸三氯甲烷配制成濃度分別為2. 00 ，4. 00 ，6. 00 ，8. 00 ，10. 00 ，12. 00 ，14. 00g/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，以0g/mL作參比管，調(diào)節(jié)零點，用1cm比色杯于276.5nm下測量吸光度A，得出吸光度-咖啡因濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線或求出直線回歸方程。圖2 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線3 測定在25mL具塞試

39、管中，加入5g無水硫酸鈉，倒入20mL樣品的三氯甲烷制備液，搖勻，靜置。將澄清的三氯甲烷用1cm比色杯于276.5nm測出其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（直線回歸方程）求出樣品的吸光度相當(dāng)于咖啡因的濃度C（g/mL）。這時用重蒸三氯甲烷作試劑空白。（三） 實驗結(jié)果1 計算可樂型飲料中咖啡因含量.咖啡、茶葉及其固體制成品中咖啡因含量(mg/100g)咖啡、茶葉及其固體制成品中咖啡因含量(mg/100g) QUOTE * MERGEFORMAT （3）式中:C樣品吸光度相當(dāng)于咖啡因濃度（g/mL） C0試劑空白吸光度相當(dāng)于咖啡加濃度（g/mL） m稱取樣品的重量（g） V 移取樣品的體積（mL） V1移取

40、樣品處理后水溶液的體積（mL）2 本實驗條件下 本法儀器檢出限為0.2g/mL，方法檢出限可樂型飲料為3mg/L，咖啡、茶葉及其固體制成品為5mg/100g，咖啡或茶葉的液體制品為5mg/L。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍： 0.030.0g/mL。相關(guān)系數(shù)：0.999。方法回歸率：90.1101.8%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：4.0%。3 允許差 同一實驗室平行測定或重復(fù)測定結(jié)果的相對偏差絕對值可樂型飲料為10%，咖啡、茶葉及其制品為15%。（四） 實驗條件的選擇1 吸收曲線從圖3可見，咖啡因最大吸收峰，在276.5毫微米處。 圖3 咖啡因吸收曲線2 pH的影響吸取10微克標(biāo)準(zhǔn)咖啡因溶液于50毫升容量瓶或燒杯中，加

41、水至45毫升，用0.1NHCI和0.1NNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH110。然后分別倒人250毫升的分液漏斗中，以下操作按提取(1)進(jìn)行。結(jié)果見圖4。 圖4 pH值對提取效果的影響；在pH6.0以一下時，當(dāng)劇烈振搖時，易乳化，分層慢，在pH6.010.0沒有以上現(xiàn)象。3 氯化鈉對方法的影響取含有咖啡因毫克的樣品溶液，倒人不同濃度的氯化鈉溶液中進(jìn)行測定，得到圖5曲線。由曲線可知，氯化鈉的濃度對測定方法，有明顯的影響。再使用飽合鹽水00.3毫升時，提取時產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，測定結(jié)果偏低；使用飽合鹽水0.51.5毫升時，其吸光度的變化，趨于平穩(wěn)，回收率為98.5%，故選定飽合鹽水加入量為1.0毫升，作為測定條件

42、最宜濃度。加入飽和鹽水1.sml以上時，產(chǎn)生大量沉淀物，其測定結(jié)果偏低。圖5 氯化鈉溶液濃度對提取效果影響4 萃取時間萃取搖蕩時間的長短，對吸光度值無明響地影響，所以我們選定搖蕩時間為l分鐘。5 提取溶劑的使用量根據(jù)目前市售可樂型飲料中的咖啡因濃度，取不含咖啡因的可口可樂（預(yù)先將咖啡因全部提出來）100毫升，加入標(biāo)準(zhǔn)咖啡因40毫克，以不同體積的三氯甲烷分別萃取三次，得到總回收率見表3。表3 三氯甲烷提取溶劑的使用量（毫升）第一次使用（ml）第一次使用（ml）第一次使用（ml）第一次使用（ml）第一次使用（ml）43296854312654158641887520128525表3結(jié)果說明，提取劑

43、三氯甲烷使用量，在18毫升以上均可提取完全，為了適應(yīng)各種可樂型飲料，故將提取溶劑定為50ml。6 方法精密度為了檢查本方法的精密度，根據(jù)上述實驗條件，得到表4。表4 咖啡因回收率對比表樣品含咖啡因（毫克）加入標(biāo)準(zhǔn)咖啡因（毫克）測得總咖啡因（毫克）回 收 率（%）10010095100從表4的結(jié)果，說明方法的精密度比較高，同時在原料和成品中做出的回收率是一致的，其平均回收率了98.61%，標(biāo)淮偏差Sx2.70，變動系數(shù)CV2.94。（五） 結(jié)果與討論1 標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察咖啡因的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知隨著咖啡因含量的增加,其在最大吸收波長處的吸光度也逐漸增加,呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系.線性方程為:Y= 0.031 7

44、4+0.050 62X.相關(guān)系數(shù)r= 0.999 7.2 咖啡因分析條件的優(yōu)化（1） 溶劑的選擇準(zhǔn)確移取三份1.0 mL 200 mg/L咖啡因水溶液于三支10 mL比色管中，分別加入二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯8.0 mL，充分震蕩，萃取后離心分離，取清液在250300 nm波長范圍內(nèi)掃描。比較咖啡因在不同溶劑中的紫外吸收光譜，可以看出三氯甲烷作溶劑時，吸光度最大，最大吸收峰位于276 nm。由此可知三氯甲烷的萃取效率最佳。因此，本實驗選用三氯甲烷作溶劑。（2） 樣品和溶劑的混合體積比選擇本實驗選用5 mL溶劑，樣品用量分別選0.35 mL、0.60 mL、1.00 mL，即體積比分別為14

45、:1、8:1、5:1進(jìn)行測定,結(jié)果見表5。廠家報道的咖啡因含量為:可口可樂95.7 mg/L,百事可樂104.2 mg/L11。從表5可以看出14:1與8:1時所測得的萃取液中的咖啡因濃度與標(biāo)準(zhǔn)值相近。而5:中溶劑與溶液的體積比采用8:1。表5 三氯甲烷與樣品不同體積比混合所測得的咖啡因濃度（mg/L）樣 品 體 積 比14:18:15：1可口可樂（瓶裝）百事可樂（瓶裝）（3）樣品分析和標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率用本研究中建立的方法對康師傅綠茶、康師傅紅茶、可口可樂(瓶裝)、可口可樂(灌裝)、百事可樂(瓶裝)、百事可樂(灌裝)中的咖啡因含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表6。從表6可以看出康師傅紅茶中所含咖啡因的濃度最小，為54.29