分子生物學(xué)實驗

1、分子生物學(xué)實驗第1頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一 基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。 利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達(dá)到提取的目的。 在提取過程中,染色體會發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時應(yīng)盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構(gòu)建基

2、因組文庫, 初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析, DNA長度可短至50kb, 在該長度以上,可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。 第2頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗建立相應(yīng)的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對隨后的酶切、P

3、CR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時, 應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。本實驗以動物肝臟為材料,學(xué)習(xí)基因組DNA提取的一般方法。 第3頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一提純的思路基因組DNA的特性：分子量較大、易斷（如何保證DNA分子的完整性？）2. 組織和細(xì)胞的破碎3. 要去除的物質(zhì)： 蛋白、多糖、脂類、RNA和小分子物質(zhì) 第4頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一一、材料 哺乳動物新鮮組織。 二、設(shè)備 移液管高速冷凍離心機(jī)臺式離心機(jī)水浴鍋。 第5頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一三、試劑：1. 組織勻

4、漿液 200 mL 滅菌備用 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 25mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl2. 酶解液 100 mL （滅菌后再加蛋白酶K和SDS) 20mmol/L Tris-HCl pH 8.0 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200ug/mL蛋白酶K 1SDS 第6頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一3. 生理鹽水(0.7%) 1000 mL 滅菌備用4. 3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 滅菌備用 先用50mL水溶解固體NaAc 再用3mol/L乙酸調(diào)pH至5.2，最后定容同時滅

5、菌備用：槍頭： 1mL 、200uL 各一盒小指管: 2.0、0.5mL各20個研磨棒: 20支無菌水：250ml X 2瓶第7頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一四、實驗步驟 基因組DNA的提取：0.2g鼠肝，冰冷生理鹽水洗3次，剪碎加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL勻漿液混勻勻漿液轉(zhuǎn)入2mL小指管，40C , 5000rpm離心2min,沉淀加0.4mL無菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢顛倒混勻550C 水浴酶解過夜或2小時以上，40C存放第8頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一（加RNase ,終濃度200ug/mL，370C保溫60mi

6、n）加等體積酚/氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻，冰上平倒靜置10-20min40C，10000rpm離心10min，用擴(kuò)口槍頭取出上清上清加等體積氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻40C,10000rpm，用擴(kuò)口槍頭取上清第9頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一上清加1/10體積的NaAc和加2倍體積的無水乙醇慢慢混勻沉淀DNA，-200C靜置30min，DNA沉淀形成白色絮狀物。 12000rpm離心15min，棄上清沉淀用1mL 75%冷乙醇洗兩次，每次12000rpm離心10min，棄上清超凈臺中干燥加 50uL TE, 40C溶解過夜，-200C保存第10頁，共14頁，2022

7、年，5月20日，9點59分，星期一基因組DNA的檢測 前述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA產(chǎn)量及質(zhì)量均不同,有時DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì),會影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。 1. DNA溶液稀釋20-30倍后,測定OD260 /OD280 比值, 明確DNA的含量和質(zhì)量。 () 2. 取2-5l 在0.7% agarose膠上80V電泳, 檢測DNA的分子大小。 () 3. 取2g DNA, 用10單位(U)Hind酶切過夜, 0.7% agarose膠上電泳, 檢測能否完全

8、酶解(做RFLP, DNA必須完全酶解)。 第11頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一 如果DNA中所含雜質(zhì)多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影響接續(xù)的分析和操作,可以用下列方法處理： （1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。 （2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白質(zhì)和多糖。 （3）Sepharose柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度離心, 去除雜質(zhì), 分離大片段DNA(可用作文庫構(gòu)建)。 第12頁，共14頁，2022年，5月20日，9點59分，星期一可能的結(jié)果：由于基因組DNA比較難溶、且容易被降解，電泳時經(jīng)常會出現(xiàn)彌散的或不均一的條帶（如左圖）。所以實驗時一定要注意機(jī)械力對大分子DNA的破壞作用，如避免振蕩、使用擴(kuò)口槍頭等。另外