臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)主管講義細(xì)胞因子

1、第十六章 細(xì)胞因子與細(xì)胞黏附因子的測(cè)定第一節(jié) 生物學(xué)測(cè)定方法常見(jiàn)的生物學(xué)測(cè)定法包括：基于的分子生物學(xué)測(cè)定法和生物活性測(cè)定法。前者有細(xì)胞因子或細(xì)胞黏附分子 DNA 擴(kuò)增法、RNA 印跡法、原位雜交法、核酸酶保護(hù)分析等，可定性或定量分析細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子的或 mRNA。后者則是根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物活性而設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法，主要用于細(xì)胞因子的測(cè)定。生物活性測(cè)定法的基本原理，是根據(jù)不同細(xì)胞因子所具有的某一方面獨(dú)特的生物學(xué)活性，構(gòu)建發(fā)揮這一活性的反應(yīng)體系，通過(guò)觀察其活性作用的結(jié)果，判斷有無(wú)相應(yīng)細(xì)胞因子的存在。有助于細(xì)胞因子檢測(cè)的活性作用大致有以下幾類(lèi)：刺激細(xì)胞增殖或集落形成的活性維持細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的特

2、性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或破壞細(xì)胞的效應(yīng)4.促進(jìn)細(xì)胞趨化或抗作用等一、促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞增殖測(cè)定法直接細(xì)胞代謝活性測(cè)定方法細(xì)胞代謝產(chǎn)物測(cè)定法常用放射性核素?fù)饺敕ê?MTT 比色法二、細(xì)胞毒活性測(cè)定法對(duì)指示細(xì)胞具有破壞作用的細(xì)胞因子，若與細(xì)胞共育將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞。因此，待測(cè)細(xì)胞因子做一系列稀釋后加至指示細(xì)胞培養(yǎng)體系，以檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的死細(xì)胞數(shù)作為判斷指標(biāo)，死細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞因子的活性成正比。本法常用于 TNF 等的測(cè)定。三、抗活性測(cè)定法抗活性測(cè)定法主要用于 IFN 等細(xì)胞因子的檢測(cè)。四、趨化活性測(cè)定法其誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的方式包括趨化性和化學(xué)增活性。趨化性可采用瓊脂糖和 Boyden 盲端微孔小室趨化試驗(yàn)測(cè)定?；瘜W(xué)

3、增活性可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)測(cè)定。五、生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)細(xì)胞因子生物學(xué)活性測(cè)定法主要具有以下特點(diǎn)：敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾第二節(jié) 免疫測(cè)定方法一、ELISA 方法雙抗體夾心法是用于細(xì)胞因子測(cè)定的最常用方法。細(xì)胞因子測(cè)定的標(biāo)本主要包括兩大類(lèi)，一是（血漿）、關(guān)節(jié)液、胸腔液 、腦脊液或腹腔液等體液，可用于細(xì)胞因子和可溶性黏附分子的檢測(cè)；二是細(xì)胞體外培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液，只用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。二、流式細(xì)胞分析法流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面黏附分子的檢測(cè)，通過(guò)特異性的熒光抗體染色，能簡(jiǎn)單、快速

4、地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或黏附因子的檢測(cè)，精確判斷不同細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。根據(jù)熒光抗體的性質(zhì)，熒光抗體染色分直接法和間接法，前者使用熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子或黏附分子的特異性抗體，后者則用熒光標(biāo)記二抗。直接法較為常用，其敏感性雖不及間接法，但特異性強(qiáng)。該法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子時(shí)，主要包括以下基本步驟：分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞細(xì)胞固定封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)染色與分析三、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)其基本原理是：在有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，在有或無(wú)刺激物存在的條俺下培養(yǎng)后，待測(cè)細(xì)胞細(xì)胞因子于其周?chē)⒈话迳系奶禺愋钥贵w捕獲。細(xì)胞因子或其他可溶性分子的細(xì)胞。細(xì)胞的檢測(cè)方法

5、，能從 20 萬(wàn)30 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)出 1 個(gè)相應(yīng)分子四、免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：特異性高，使用特異的單克隆抗體，可用于單一細(xì)胞因子的檢測(cè)。操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴(lài)細(xì)胞株，故不需維持培養(yǎng)，使方法的可操作性大大增加，容易推廣和便于普查。影響缺點(diǎn)：相對(duì)較少且容易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定成正比。測(cè)定結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系，使用不同來(lái)源親和力的單抗，對(duì)同一標(biāo)本測(cè)到的結(jié)果可能不同。敏感性相對(duì)較低,比生物活性法約低 10100 倍，測(cè)定下限一般為 100pg。若標(biāo)本中存在細(xì)胞因子的可溶性受體，可能會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合。第三節(jié) 細(xì)胞因子與細(xì)胞黏附分子測(cè)定的臨床應(yīng)用細(xì)胞因子的測(cè)定主要用于以下幾方面：1.特定疾病的輔助；機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)估；臨床疾病治療效果的監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)用藥；疾病預(yù)防的應(yīng)用。一、臨床