動物組織中核酸的提取與鑒定

1、動物組織中核酸的提取與鑒定第1頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一實驗原理實驗試劑實驗步驟第2頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一實驗原理 動物組織細胞中的核糖核酸(RNA)與脫氧核糖核酸(DNA)大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。可用三氯醋酸沉淀出核蛋白，并用95%乙醇加熱除去附著在沉淀上的脂類 雜質(zhì)。然后用10%氯化鈉從核蛋白中分離出核酸(鈉鹽形 式)，此核酸鈉鹽，加入乙醇可以被沉淀析出。 析出的核酸(DNA與RNA)均由單核苷酸組成，在單核苷酸中含有磷酸、有機堿(嘌呤與嘧啶)或戊糖(核糖、脫氧核糖)。核酸用硫酸水解后，即可游離出這三類物質(zhì)。用下述方

2、法可分別鑒定出這三類物質(zhì)： 第3頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一1磷酸：用鉬酸銨與之作用可生成磷鉬酸，磷鉬酸可被氨 基奈酚磺酸還原形成藍色鉬藍。2嘌呤堿：用硝酸銀與之反應生成灰褐色的絮狀嘌呤銀化 合物。3戊糖 (1)核糖：用硫酸使之生成糠醛，糠醛與3,5-二羥甲苯縮合 而成為一綠色化合物： (2)脫氧核糖在硫酸作用下生成,-羥基-酮基戊糖，后 者與二苯胺作用生成藍色化合物：第4頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一實驗試劑1鉬酸銨試劑 ：鉬酸銨2.5g溶于20mI蒸餾水中，再加入5mol/L硫酸 30ml，用蒸餾水稀釋1OOml。2氨基奈酚磺酸 ：

3、商品氨基奈酚磺酸(1，2，4-Amino- naphthol Sulfonic Acid)為暗灰色。用下法提純后使用:在100ml 蒸餾水中(90)溶解15g亞硫酸氫鈉及1g亞硫酸鈉， 加入1.5g商品氨基奈酚磺酸，攪拌使大部分溶解(僅 少量雜質(zhì)不溶解)，趁熱過濾，再迅速使濾液冷卻。 加入lml濃鹽酸，則有白色氨基奈酚磺酸沉淀析出。 過濾并洗滌固體數(shù)次。再用乙醇洗滌直到純白色為 止。最后用乙醚洗滌，并將固體放在暗處，使乙醚揮 發(fā)。將此提純的氨基奈酚磺酸保存于棕色瓶中備用。第5頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一 氨基奈酚磺酸溶液配制：取195ml的15%亞硫酸氫鈉溶液(溶

4、液必須透 明)加入0.5g提純的氨基奈酚磺酸及20%亞硫酸鈉溶液5ml。并在熱水 浴中攪拌使固體溶解(如不能全部溶解，可再加20%亞硫酸鈉溶液，每 次數(shù)滴，但加入量以lml為限度)。此為濃溶液。置冰箱可保存2-3周，如顏色變黃時，須重新配制。臨用前，將上述濃溶液以蒸餾水稀釋10倍。 3、3，5-二羥甲苯溶液取密度1.19的鹽酸100ml，加入六水氯化鐵 100mg及二羥甲苯100mg，混勻溶解后，置于棕色瓶中。此試劑宜 在臨用前新配制。市售的3，5-二羥甲苯若不純必須用苯重結(jié)晶一、 二次，并用活性碳脫色方可使用。4二苯胺試劑：取1g純的二苯胺溶于100m1重蒸餾的冰乙酸中(或分析 純冰乙酸)，

5、加入2.75ml濃硫酸，搖勻。放在棕色瓶中保 存。此試劑需臨用時配制。5 0.9%Nacl。6 20%三氯醋酸。7 95%乙醇。第6頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一實驗步驟(一)勻漿制備 稱取新鮮豬肝(或大白鼠肝臟)5克，加入等量冰冷的 0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成勻漿后加入剩余 部分），及時剪碎。放人研缽中加入少量石英砂，研磨成 勻漿。研磨過程中，要隨時將研缽置于冰中冷卻。（勻漿制備一定要在低溫條件下制作，操作要迅速，以避免核酸 分解。） 第7頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一(二)分離提取 1將勻漿5m1置于離心管內(nèi)，立即加入

6、20%三氯醋酸5ml，用玻棒攪 勻，靜3min后，以3000r/min離心l0min。 2傾去上清液，沉淀中加入95%乙醇5m1，用玻棒攪勻。用一個裝 有長玻璃管的木塞塞緊離心管口，在沸水浴中加熱至沸，回餾 2min。 注意乙醇沸騰后將火關小，以免乙醇蒸氣燃燒。冷卻后2500r/min 離心l0min。（脫脂） 3傾去上層乙醇。將離心管倒置于濾紙上，使乙醇倒干。沉淀中加入 10%氯化鈉溶液4ml，置沸水浴中加熱8 min ，并用玻棒攪拌。取 出待冷卻以2500r/min離心l0min 。 4將上層清液量取體積后傾人一小燒杯內(nèi)。若不清亮可重復離心一 次。 5取等量在冰浴中冷卻的95%乙醇（在冰箱

7、中），逐滴加入小燒杯 內(nèi)。即可看見白色沉淀析出。靜置l0min后，轉(zhuǎn)人離心管 3000/min，離心10min，即可得核酸的白色鈉鹽沉淀。第8頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一（四）DNA與RNA成分的鑒定 1磷酸的鑒定 取試管2支，按表操作管號水解液5%硫酸鉬酸銨試劑氨基奈酚磺酸測定對照10滴10滴5滴5滴20滴20滴第9頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一2嘌呤堿的鑒定:取試管2艾，按表操作管號水解液5%硫酸 濃氨水 5%AgNO3測定對照20滴20滴數(shù)滴使呈堿性數(shù)滴使呈堿性10滴10滴第10頁，共12頁，2022年，5月20日，15點47分，星期一3核糖的鑒定 取試管2支，按表操作 將2支試管放入沸水浴內(nèi)加熱10min 管號水解液5%硫酸3，5二羥甲苯試劑測定對照4滴4滴6滴6滴第11頁，共12頁，2022年，