人類血小板同種抗原研究進(jìn)展

1、人類血小板同種抗原研究進(jìn)展【摘要】人類血小板同種抗原h(huán)uanplateletallantigens,HPA是由血小板糖蛋白攜帶的一類特異性抗原，其基因具有單核苷酸多態(tài)性SNP。HPA可介導(dǎo)同種抗體的產(chǎn)生，引起同種免疫反響，與輸血后血小板減少性紫癜PTP、血小板輸注無效PTR，新生兒同種免疫血小板減少性紫癜NAITP及移植排擠親密相關(guān)。因其在臨床輸血理論及相關(guān)疾病中的重要作用，而備受關(guān)注。本文就HPA抗原的命名、血小板糖蛋白多態(tài)性、HPA檢測方法、血小板同種免疫反響機(jī)制以及相關(guān)疾病研究進(jìn)展作一綜述?！娟P(guān)鍵詞】HPA;血小板糖蛋白復(fù)合物多態(tài)性;檢測方法AdvanesintheStudiesnHua

2、nPlateletAllantigenRevieKeyrdsHPA;plateletglyprteinsplyrphiss;detetinethd人類血小板同種抗原h(huán)uanplateletallantigen,HPA是分布在血小板糖蛋白上一類特異性抗原，又稱血小板特異性抗原。在目前已檢測出的24個(gè)HPA抗原中,除HPA-14b基因是因核苷酸1909到1911位置上AAG3個(gè)堿基缺失產(chǎn)生外,其他的HPA基因均具有單核苷酸多態(tài)性(SNP)1。HPA可介導(dǎo)同種抗體的產(chǎn)生，引起同種免疫反響，引發(fā)同種免疫性血小板減少，如輸血后血小板減少性紫癜PTP、血小板輸注無效PTR及新生兒同種免疫血小板減少性紫癜N

3、AITP，同時(shí)在臨床移植中，還會(huì)引起移植排擠等相關(guān)的疾玻準(zhǔn)確檢測和鑒定HPA，對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)和輸血理論具有重要意義。血小板抗原血小板外表具有復(fù)雜的血型抗原，如AB和一些多糖抗原，在輸血中起重要作用。通常血小板抗原可分為兩大類：一類是血小板相關(guān)抗原，與其他細(xì)胞外表或組織共有的抗原，主要與紅細(xì)胞的AB血型系統(tǒng)以及HLA有關(guān)；另一類是血小板特異性抗原，由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)血小板獨(dú)特的遺傳多態(tài)性，只在血小板和巨核細(xì)胞上表達(dá)。先前被看作是“血小板特異性的血小板同種抗原也存在于其他細(xì)胞或組織上2。血小板特異性抗原人類血小板同種抗原HPA是通過相應(yīng)抗體的檢出而發(fā)現(xiàn)的，它具有獨(dú)特的型特異性，血小板

4、特異性抗原都分布在血小板糖蛋白上，構(gòu)成血小板膜構(gòu)造中的一部分3。血小板特異性抗原屬于雙等位共顯性遺傳系統(tǒng)，HPA多態(tài)性分布存在種族差異4。命名法那么1959年，VanLghe等3在屢次輸血的婦女血清中，發(fā)現(xiàn)Za，這是第一個(gè)被鑒定的人類血小板抗原。隨后，人類血小板抗原的研究開場。20世紀(jì)60年代到90年代，K,Bak,Yuk,Gv,ax相繼被發(fā)現(xiàn)。1990年，為防止新舊血小板抗原名稱的混淆，國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)、國際輸血協(xié)會(huì)ISBT血小板血清學(xué)研討會(huì)決定，在系統(tǒng)前冠以HPA，即表示人類血小板特異性抗原。2022年，由國際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)和國際血栓和止血協(xié)會(huì)(ISTH)結(jié)合成立的血小板命名委

5、員會(huì)(PN),對(duì)HPA進(jìn)展了系統(tǒng)命名,建立了命名原那么和認(rèn)可新抗原的標(biāo)準(zhǔn)。至今，使用血清學(xué)方法已檢出24個(gè)血小板抗原，其中Vaa和ua抗原尚未到達(dá)國際命名要求,其余22個(gè)抗原已被PN正式命名見附表。HPA命名原那么是以HPA加數(shù)字表示。在共顯性雙等位基因的遺傳系統(tǒng)中,a表示基因頻率大于50%的等位基因,b表示基因頻率小于50%的另一等位基因。假設(shè)其中一個(gè)等位基因尚未被發(fā)現(xiàn),那么在數(shù)字后加5。目前的系統(tǒng)有6對(duì)：HPA-1-HPA-5，HPA-15。24個(gè)抗原主要分布在糖蛋白GPb，GPa，GPb，GPa以及D109上，詳細(xì)分布情況及其單核苷酸多態(tài)性見附表。血小板糖蛋白復(fù)合物及其多態(tài)性糖蛋白GPb

6、/a復(fù)合物多態(tài)性GPaD61，3是1個(gè)90kD的單鏈蛋白，由3個(gè)構(gòu)造域組成：由28個(gè)二硫鍵高度穿插連接的細(xì)胞外區(qū)域；跨膜構(gòu)造域；短的細(xì)胞質(zhì)化的片段。GPbD41，b是跨膜蛋白，細(xì)胞外116kD的重鏈，通過二硫鍵與22kD的輕鏈共價(jià)結(jié)合。GPb/a復(fù)合物是由和非共價(jià)結(jié)合組成的異二聚體整連蛋白(見圖)。GPb和GPa糖蛋白分別由位于第17號(hào)染色體長臂上的ITGA2B和ITGB3基因所編碼。GPb上攜帶HPA-3和HPA-9b；GPa攜帶9種HPA抗原，分別為HPA-1，HPA-4，HPA-6b，HPA-7b，HPA-8b，HPA-10b，HPA-11b，HPA-14b，HPA-16b6(見附圖)。

7、Table.Huanplateletallantigens略糖蛋白GPb/V/復(fù)合物多態(tài)性糖蛋白GPb/V/復(fù)合物(D42,vn-illerbrand因子受體)有4個(gè)跨膜組分：GPbD42b，143kD與GPbD42，22kD由1個(gè)二硫鍵共價(jià)連接；GPD42a，20kD和GPVD42d，83kD非共價(jià)結(jié)合。以上4種糖蛋白都是富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白家族成員。編碼GPb的基因GP1BA位于第17號(hào)染色體上，編碼GPb的基因GP1BB位于第22號(hào)染色體上；編碼GPV和GP的基因均位于第3號(hào)染色體上。GPb攜帶HPA-2(見附圖)；GPb攜帶HPA-12b；GPV和GP無多態(tài)性6。糖蛋白GPa-a復(fù)

8、合物多態(tài)性GPa是一條165kD的2鏈，GPa是一條145kD的1鏈(見附圖)。GPa，又稱PEA-1，糖蛋白GPa-aD49/D29，21復(fù)合物也存在于活化的T淋巴細(xì)胞和幾類其他類型的細(xì)胞中。和鏈與膠原蛋白的結(jié)合依賴g2+。GPa/a中，只有GPa有多態(tài)性，編碼的GPa基因ITGA2位于第5號(hào)染色體上，GPa攜帶HPA-5和HPA-13b6(見附圖)。D109糖蛋白D109糖蛋白位于活化的血小板和T細(xì)胞上，編碼基因位于第6號(hào)染色體上。D109糖蛋白是與糖基磷脂酰肌醇GPI連接的單聚體，約170kD，是2巨球蛋白/3，4，5含硫代酯蛋白家族的成員7，D109糖蛋白攜帶HPA-15Gv，具有兩個(gè)

9、等位基因HPA-15a，HPA-15b，HPA-15突變遺傳因子是由A-單核苷酸多態(tài)性反映的，A-單核苷酸取代發(fā)生在D109DNA的編碼區(qū)2108位點(diǎn)，使D109的第682位氨基酸發(fā)生Tyr/Ser替代8(見附圖)。HPA抗原檢測方法血清學(xué)方法血小板免疫熒光試驗(yàn)PIFT1978年，Vn-denBrne等9創(chuàng)造了PIFT。該法用待測血清孵育血小板，洗滌，再與熒光物標(biāo)記的抗球蛋白反響后洗滌，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。該法是較為可靠的血小板定型方法,1986年被國際血小板血清學(xué)研討會(huì)確定為標(biāo)準(zhǔn)的參考方法。流式細(xì)胞術(shù)(F)1986年,Rsenfeld等10創(chuàng)造了此技術(shù)。該法將待測血清和熒光標(biāo)記的型別的血

10、小板抗體孵育后，用流式細(xì)胞儀檢測11。F用于免疫性血小板減少癥患者的血小板相關(guān)抗體及血小板膜糖蛋白檢測,具有靈敏、快速、簡便的特點(diǎn),是適用于臨床診斷的新方法12。單克隆抗體免疫固定血小板抗原方法AIPA1987年，Kiefel等13建立了單克隆抗體免疫固定血小板抗原方法，是目前使用最為廣泛的方法。該法先制備羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，將鼠抗人血小板糖蛋白單克隆抗體和帶有抗體的血小板共同孵育，再將孵育后的復(fù)合物參加多孔板，孵育，洗滌，最后參加酶聯(lián)羊抗人抗體和酶反響底物后顯色，定量測定血小板抗體。此方法敏感度高、特異性強(qiáng)，即使是血小板上抗原數(shù)量很少的HPA-5抗原，也能檢測出。AIPA方法可靈

11、敏地檢測血小板特異性抗體。簡易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)試驗(yàn)SEPSA1993年，由劉達(dá)莊等14創(chuàng)造。該法以抗人IgG抗體致敏紅細(xì)胞為指示細(xì)胞，直接指示固相血小板抗原抗體免疫反響，檢測血小板抗體11。假設(shè)血小板上存在抗體，那么指示細(xì)胞呈擴(kuò)散分布，為陽性；假設(shè)無抗體，那么指示細(xì)胞聚集在底部，呈扣狀，為陰性。該方法操作簡單，微量，重復(fù)性、特異性和敏感性均較理想，固相化的血小板及抗IgG指示細(xì)胞能長久保存?zhèn)溆?，可開展大量樣本的檢測工作3。單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)該法用多聚甲醛固定抗血小板糖蛋白單克隆抗體后，參加待測血清，最后加辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgG，用底物鄰苯二胺-phenylenediain

12、ePD顯色11。放射免疫沉淀放射免疫沉淀使用放射性同位素標(biāo)記的血小板膜蛋白，與受檢血清結(jié)合，電泳別離后采用自身顯影原理檢測是否存在血小板抗體1?；蚍中头椒ň酆厦告?zhǔn)椒错懶蛄刑禺愐锓中图夹g(shù)PR-SSP1993年,etalfe等15首次運(yùn)用序列特異性引物PR成功地對(duì)HPA-1進(jìn)展分型。SSP-PR的原理：設(shè)計(jì)特異性引物，利用引物3端的特異性，直接擴(kuò)增相應(yīng)的HPA片段，PR產(chǎn)物凝膠電泳以后，以紫外線透射來檢測，DNA條帶的存在或缺失即可確定基因型。特點(diǎn)：SSP-PR操作比擬簡單，耗時(shí)較少，合適小批量標(biāo)本，是目前HPA基因定型中最常用的一種技術(shù)。實(shí)時(shí)定量PRreal-tiequantitative

13、PR實(shí)時(shí)定量PR原理：在PR指數(shù)擴(kuò)增期間，利用連續(xù)監(jiān)測熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來即時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量16。它廣泛應(yīng)用于定量檢測RAN表達(dá)程度，其特點(diǎn)是易操作、高通量、敏感性高和特異性強(qiáng)。最近，F(xiàn)ik等17運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PR技術(shù)分析了血小板糖蛋白GP-a基因的表達(dá)。TaqanT技術(shù)是美國PerkinEler公司研制的一種實(shí)時(shí)PR技術(shù)18,它利用了Taq多聚酶的核酸酶活性。Taq酶在引物延伸過程中，特異性移去雜交的探針，利用其5核酸酶活性將探針劈開，釋放出指示熒光染料，指示染料的熒光強(qiáng)度隨著每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)而增加。這一方法成功運(yùn)用于HPA-1、-2和-3基因定型19。2000年，美

14、國AppliedBisystes公司開發(fā)了一種新的Taqan-GB20，進(jìn)一步加強(qiáng)了TaqanSNP檢測的才能。基因芯片技術(shù)DNAirarray基因芯片技術(shù)利用正向雜交的方法，制成針對(duì)HPA基因SNP位點(diǎn)的DNA芯片；用熒光標(biāo)記的HPA型特異性探針分別與芯片進(jìn)展雜交，用軟件分析樣品的雜交結(jié)果，從而確定樣品的HPA基因型。此技術(shù)特點(diǎn)是一次性可同時(shí)檢測大量樣品，快速，準(zhǔn)確。近來，Brs21等用基因芯片對(duì)HPA-1等位基因系統(tǒng)分型，證明此方法適用于HPA基因分型。限制性片段長度多態(tài)性分析PR-RFLP限制性片段長度多態(tài)性分析RFLP原理是：限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別DNA序列上的特異性位點(diǎn)，并切割產(chǎn)生一定

15、長度的DNA片段。相關(guān)基因片斷用含SNP區(qū)域的引物進(jìn)展擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用一種限制性酶進(jìn)展降解，酶解的PR產(chǎn)物進(jìn)展聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，最后在紫外線下進(jìn)展DNA片斷的帶型分析22。該法特點(diǎn)是RFLP是利用限制性內(nèi)切酶酶解相應(yīng)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物，不需探針雜交，但被測的HPA基因需有適宜的限制性酶切位點(diǎn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒错懙任换蛐蛄刑禺愋怨押塑账犭s交PR-AS1990年,Lyan等23創(chuàng)造了聚合酶鏈?zhǔn)椒错?等位基因序列特異性寡核苷酸PR-AS技術(shù)。該方法用PR擴(kuò)增SNP的基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到尼龍膜支持物上，再與標(biāo)記的等位基因特異性的指示物-寡核苷酸探針雜交。該方法特點(diǎn)是以雜交為根底的檢測技術(shù)，但需嚴(yán)

16、格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照防止假陽性和假陰性。同源雙鏈優(yōu)先形成試驗(yàn)PR-PHFA同源雙鏈優(yōu)先形成試驗(yàn)PHFA原理：雙標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)雙鏈DNA，它的兩條鏈分別被生物素和鄰苯二甲酸二壬酯(dinnylphthalate,DNP)標(biāo)記與未標(biāo)記的待測DNA雙鏈之間雜交時(shí)的競爭24。該方法特點(diǎn)：不需要電泳，可用軟件進(jìn)展結(jié)果判讀。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PR-SSP單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSP分析是rita等25創(chuàng)造的，其原理是單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率與其分子大小和三級(jí)構(gòu)象有關(guān),以此來檢測基因變異和多態(tài)性。血小板抗原同種免疫的反響機(jī)制HPA可誘導(dǎo)受血者體內(nèi)產(chǎn)生一系列同種免疫反響。通常有兩種反響

17、途徑：直接途徑和間接途徑。直接途徑中，受血者D4+T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體直接與外源HPA同種抗原決定簇反響。供體抗原呈遞細(xì)胞外表的H類分子呈遞外源HPA同種抗原決定簇。間接途徑中，外源HPA同種抗原決定簇被受體抗原呈遞細(xì)胞加工后，受體D4+T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識(shí)別受體自身的抗原呈遞細(xì)胞外表H類分子呈遞的外源HPA同種抗原決定簇。在這兩種途徑中，D4+T細(xì)胞活化需要充分的共刺激因子。D4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如白介素-2和干擾素家族，可刺激初始B細(xì)胞發(fā)育為分泌抗體的漿細(xì)胞。直接識(shí)別途徑是一個(gè)強(qiáng)而快的反響，它可激起整個(gè)TR受體庫中5%的受體。間接識(shí)別途徑中，活化的D4+T細(xì)胞減少了約99%，但假設(shè)

18、給予與直接途徑一樣的滴定量，能產(chǎn)生等量的抗體6。血小板糖蛋白是免疫識(shí)別和免疫攻擊的靶，通常被自身或同種異基因效應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞所識(shí)別。在上述兩種情況下，最終的反響是巨噬細(xì)胞F受體與免疫球蛋白分子的F片段結(jié)合后，血小板被巨噬細(xì)胞吞噬，這通常發(fā)生在脾中26，引起血小板減少癥。自身免疫的作用靶通常是非多態(tài)性的血小板糖蛋白和磷脂。同種免疫反響通常是由H-I類分子和糖蛋白GPb/a，GPb/V/，GPa-a，GP上的同種抗原引起的，在臨床上引發(fā)NAITP，PTP，PTR。HPA與臨床相關(guān)疾病新生兒同種免疫性血小板減少癥NAITPNAITP是因胎兒與母親的血小板血型不合，而使母親產(chǎn)生同種抗體，同種抗體通過

19、胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒的血小板特異性抗原發(fā)生反響，導(dǎo)致胎兒和新生兒血小板減少。基于胎兒和母親之間不同的免疫基因，血小板抗體在懷孕期就產(chǎn)生了。通常這些抗體是抗HLA-類分子以及少數(shù)的抗HPA。在15%-30%懷孕的婦女中發(fā)現(xiàn)有HLA抗體，但不表現(xiàn)出因胎盤的免疫防御機(jī)制而造成嚴(yán)重威脅27。曾報(bào)道，HPA同種抗原在懷孕期的免疫識(shí)別是HLA限制性的。具有HLA-DR52aDR133*0101等位基因的HPA-1a陰性婦女，敏感地與胎兒的HPA-1a抗原反響，說明HPA-1a與HLA-DR52a之間可能存在高度關(guān)聯(lián)28。在HLA-DR6單體型的孕婦中，可能存在HPA-5b同種免疫應(yīng)答類似的聯(lián)絡(luò)29。調(diào)

20、查顯示，大多數(shù)NAITP是由HPA-1a同種抗體引起的；其次是HPA-5b，近來也有報(bào)道HPA-15不合也會(huì)導(dǎo)致NAITP30。治療措施主要是給患者輸入母體中同種抗體無反響性的血小板，或?qū)純哼M(jìn)展換血治療。預(yù)防方法主要是對(duì)母親作血漿置換治療。輸血后紫癜PTP輸血后紫癜通常是在輸全血或血小板后發(fā)生的，絕大多數(shù)為女性。在輸血后的6-10天，血小板數(shù)量減少，嚴(yán)重者有內(nèi)臟和顱內(nèi)大出血。輸血后紫癜主要由HPA-1a引起的占80%-90%，HPA-1b，HPA-3b，HPA-15也會(huì)引起PTP。Taaning31等發(fā)現(xiàn)，在血小板減少癥階段，IgG和Ig家族的特異性抗體，特異性地攻擊血小板GPb-a，GPb

21、-，GPa-a，與HPA同種抗體同時(shí)形成，這些短暫的反響抗體可能是PTP中血小板破壞的原因。治療方法：血漿置換，同時(shí)輸注配合的濃縮血小板，患者的血小板計(jì)數(shù)會(huì)上升。血小板輸注無效PTR血小板輸注無效是由于患者反復(fù)輸注血小板而產(chǎn)生了血小板同種抗體，導(dǎo)致再次輸入血小板時(shí)，發(fā)生免疫反響。主要是由血小板HLA抗原HLA-A，-B，-以及少數(shù)HPA抗原引起的，重復(fù)輸注的血液成分中含有白細(xì)胞，HLA抗體在所有病人中到達(dá)50%-90%，同時(shí)，也有17%-25%的HPA抗體出現(xiàn)，縮短輸注血小板的壽命32。在日本人中HPA-2b是引起血小板輸注無效的主要原因之一。治療方法：輸注配合的濃縮血小板。移植排擠在骨髓移植及器官移植中，HPA抗原是引起相關(guān)排擠反響的原因之一。骨髓移植是治療白血病的最正確方案，其成功率由供者與受者之間HLA配合程