人脫細(xì)胞羊膜負(fù)載大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程膀胱的研究

1、人脫細(xì)胞羊膜負(fù)載大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程膀胱的研究【摘要】目的討論人脫細(xì)胞羊膜Huanaellularanitiebrane，HAA負(fù)載大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Ss)進(jìn)展膀胱替代修復(fù)的可能性。方法用去污劑洗滌和酶消化方法制備HAA。將大鼠Ss在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、傳代。取第4代干細(xì)胞用1%二甲亞砜DS預(yù)誘導(dǎo)8h，然后應(yīng)用膀胱勻漿上清液誘導(dǎo)7d。將誘導(dǎo)分化后的Ss接種于HAA外表進(jìn)展短暫體外培養(yǎng)，獲得組織工程膀胱。將雄性大鼠60只隨機(jī)分為3組，行半膀胱切除術(shù)，然后分別采用負(fù)載干細(xì)胞后的HAAA組、HAAB組以及單純縫合組的方法進(jìn)展修補(bǔ)，每組20只。分別于術(shù)后2、4、8測(cè)定膀胱容量、進(jìn)展膀胱造影

2、并取材觀察組織再生情況。結(jié)果去污劑洗滌結(jié)合酶消化法能有效去除人羊膜中的細(xì)胞成分，光鏡及電鏡觀察無(wú)細(xì)胞成分殘留，細(xì)胞相容性好。大鼠膀胱重建術(shù)后，A、B兩組與組膀胱最大容量(Vlax)比擬有極顯著性差異P0.01，而A、B兩組之間膀胱最大容量比擬無(wú)顯著性差異P0.05。組織學(xué)觀察，2時(shí)HAA即已吸收降解，膀胱移行細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞開(kāi)場(chǎng)形成，A組吻合修補(bǔ)區(qū)較厚，平滑肌細(xì)胞規(guī)那么且豐富。結(jié)論HAA作為膀胱移植物進(jìn)展膀胱修補(bǔ)吸收降解迅速，負(fù)載Ss后構(gòu)建的組織工程膀胱是理想的替代修補(bǔ)材料?！娟P(guān)鍵詞】膀胱；移植；脫細(xì)胞羊膜；生物醫(yī)學(xué)工程最早應(yīng)用組織工程學(xué)原理進(jìn)展組織工程膀胱構(gòu)建的是akefrest大學(xué)醫(yī)學(xué)院再

3、生醫(yī)學(xué)研究所的Atala等人，他們于1998年進(jìn)展了同種異體狗再造膀胱的實(shí)驗(yàn)研究1。目前組織工程學(xué)技術(shù)的研究主要集中在二個(gè)方面：支架材料的研究與開(kāi)發(fā)；種子細(xì)胞的培養(yǎng)和植入受損的組織，使其功能得到恢復(fù)。膀胱無(wú)細(xì)胞基質(zhì)和小腸黏膜下層是目前報(bào)道最多的組織工程膀胱支架材料。羊膜是一種天然高分子生物材料，來(lái)源廣泛，不違犯?jìng)惱?。本研究采用化學(xué)去污劑和酶消化的方法去除新穎羊膜中的細(xì)胞成分，保存細(xì)胞外基質(zhì)，制備人脫細(xì)胞羊膜HAA作為支架材料，并以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Ss)為種子細(xì)胞構(gòu)建了組織工程膀胱，討論異種來(lái)源的HAA作為生物支架材料構(gòu)建組織工程膀胱的可行性。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.2種子細(xì)胞培養(yǎng)1

4、.2.1SD大鼠Ss的別離與原代培養(yǎng)21.2.2大鼠膀胱勻漿上清液對(duì)Ss的誘導(dǎo)分化8周齡大鼠4只，無(wú)菌取其膀胱，立即用PBS液沖洗，勻漿、離心，取上清液用0.2的針頭濾器過(guò)濾。取第4代Ss以2104/l密度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2d，使細(xì)胞貼壁。吸出培養(yǎng)基，換入含有1%DS的培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)8h，然后換入膀胱勻漿上清液與DE為11的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)7d。期間換液1次。1.2.3培養(yǎng)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定及純度計(jì)算1.3HAA制備1.3.1羊膜的選材1.3.2HAA細(xì)胞毒性測(cè)定按照文獻(xiàn)3要求制備HAA浸提液；取誘導(dǎo)分化的Ss按1104細(xì)胞/孔接種于96孔板，正常培養(yǎng)基組為對(duì)照組，浸提液組

5、為實(shí)驗(yàn)組；TT法測(cè)定吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率RGR,RGR實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值，并對(duì)材料毒性評(píng)分4。1.4組織工程膀胱的構(gòu)建1.4.1Ss接種誘導(dǎo)分化后的Ss以2104/l密度接種于預(yù)置22HAA的6孔培養(yǎng)板中后加培養(yǎng)基2l。置37、5%2培養(yǎng)箱內(nèi)，在飽和濕度條件下復(fù)合培養(yǎng)。1.4.2Ss/HAA復(fù)合物顯微鏡檢查收獲培養(yǎng)36h的Ss/HAA復(fù)合物，HE染色光鏡及掃描電鏡檢查。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.5大鼠膀胱修復(fù)重建實(shí)驗(yàn)1.5.1大鼠膀胱重建1.5.2術(shù)后膀胱檢測(cè)分別于術(shù)后2、4、8時(shí)，每組取5只動(dòng)物處死。處死前測(cè)定膀胱最大容積(Vlax)。方法是將膀胱排空，用注射器經(jīng)細(xì)尿管嬰幼兒輸

6、液器向膀胱注入生理鹽水，尿道外口有尿液滴出時(shí)注入的水量即為Vlax。解剖觀察膀胱大體形態(tài)，并根據(jù)標(biāo)記線取材固定，HE染色后光鏡下觀察組織學(xué)變化。第8周時(shí)各組動(dòng)物進(jìn)展膀胱造影后再進(jìn)展前述處理。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用xs表示,組間比擬采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1種子細(xì)胞培養(yǎng)2.2HAA檢測(cè)將經(jīng)物理和酶處理的HAA做HE染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)大量淺紅色膠原纖維未受損，無(wú)藍(lán)染核物質(zhì)，外表沒(méi)有殘留的細(xì)胞碎屑。掃描電鏡下HAA外表粗糙，一面為網(wǎng)狀纖維構(gòu)造，孔隙較多，大小不一。兩面均無(wú)細(xì)胞殘留(圖1)。HAA浸提液組細(xì)胞平均相對(duì)增殖率為88%，毒性評(píng)分為級(jí)表1，證明所制備的HAA組織相容性好，符合生物

7、材料應(yīng)用要求。表1細(xì)胞相對(duì)增殖率和細(xì)胞毒性分級(jí)(略)2.3組織工程膀胱構(gòu)建復(fù)合培養(yǎng)36h后HE染色觀察可見(jiàn)HAA材料上生長(zhǎng)的細(xì)胞，部分融入支架材料內(nèi)；掃描電鏡下可見(jiàn)Ss生長(zhǎng)良好，且有突起伸出固定于周?chē)Ъ懿牧蠄D1。2.4大鼠重建膀胱的大體觀察及容量測(cè)定A、B、三組術(shù)后1內(nèi)分別死亡5只、4只和1只，均死于尿外滲和膀胱周?chē)腥?。另外A、B兩組均有一只動(dòng)物有明顯尿外滲腹腔腫大，但未死亡，后尿外滲逐漸好轉(zhuǎn)。術(shù)后2時(shí)重建膀胱被大網(wǎng)膜包繞，仔細(xì)別離后可見(jiàn)標(biāo)記線內(nèi)膀胱已愈合良好，但較薄，不能識(shí)別出HAA。4、8時(shí)仍可見(jiàn)部分黏連，A、B兩組膀胱已達(dá)正常膀胱外觀，組膀胱明顯縮小，部分黏連比A、B兩組細(xì)微。2時(shí)A

8、組大鼠膀胱的Vlax為(1.210.60)l，B組為(1.120.53)l，兩組比擬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05，組(0.750.41)l,與A、B兩組比擬均有顯著差異(P0.05)。隨時(shí)間延長(zhǎng)，4、8時(shí)大鼠的膀胱容量略有增加但兩組仍無(wú)差異。8時(shí)膀胱造影見(jiàn)A、B兩組重建的膀胱與正常膀胱相似，組膀胱明顯縮小表2、圖2。2.5重建膀胱的組織學(xué)觀察A組和B組術(shù)后2時(shí)HAA修復(fù)區(qū)已有上皮細(xì)胞和膀胱平滑肌細(xì)胞形成，但B組平滑肌和上皮層較薄，平滑肌不規(guī)那么，A組那么上皮層和平滑肌略厚，相對(duì)規(guī)那么。兩組均有嗜酸細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)圖3；4和8時(shí)兩組已經(jīng)與正常膀胱組織無(wú)明顯區(qū)別。組2時(shí)切口區(qū)僅細(xì)微炎性細(xì)胞浸

9、潤(rùn)，無(wú)其他異常。表2手術(shù)各組術(shù)后不同時(shí)間Vlax的測(cè)定結(jié)果略3討論組織工程學(xué)是近年來(lái)新興起的一門(mén)學(xué)科，受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。其核心是利用組織工程學(xué)技術(shù)與生命科學(xué)的成果，將活細(xì)胞與生物材料結(jié)合，修復(fù)、重建、維持、恢復(fù)或進(jìn)步人體組織的功能5。組織工程的理想支架材料應(yīng)該具備如下條件：有良好的組織相容性；生物可降解性；無(wú)免疫原性；具有多孔性和高空隙率，利于細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng)，誘導(dǎo)組織再生；可塑性；有一定機(jī)械強(qiáng)度。而HAA作為一種天然細(xì)胞外基質(zhì)生物材料，幾乎具備以上各種生物特性，最有可能在組織體內(nèi)完全再生，并可負(fù)載細(xì)胞生長(zhǎng)。eller6將結(jié)膜細(xì)胞種植于羊膜上，BrdU標(biāo)記后植入無(wú)胸腺鼠皮下，植入后14d

10、可以追蹤到84%的標(biāo)記細(xì)胞，同時(shí)其他指標(biāo)也顯示黏附于羊膜上的細(xì)胞具有干細(xì)胞特點(diǎn)，說(shuō)明羊膜為干細(xì)胞提供了有利環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用去污劑洗滌和酶消化的方法獲得HAA，經(jīng)過(guò)光鏡和電鏡檢查，完全去除了細(xì)胞碎屑，降低了細(xì)胞免疫原性，又不損害HAA的膠原成分，采用TT法進(jìn)展了細(xì)胞相對(duì)增殖性測(cè)定，細(xì)胞相對(duì)增殖率80%，細(xì)胞毒性級(jí)，符合生物材料的應(yīng)用要求，因此是理想的支架材料。Ss與HAA在體外短暫培養(yǎng)2436h即可完成體外組織工程膀胱的構(gòu)建，掃描電鏡檢查可見(jiàn)細(xì)胞黏附固定在支架材料上。重建膀胱的組織學(xué)顯示，2時(shí)HAA移植物即已降解吸收，移行上皮和膀胱平滑肌開(kāi)場(chǎng)形成。無(wú)論單獨(dú)使用HAA還是使用Ss/HAA復(fù)合物進(jìn)展膀胱替代，均沒(méi)有發(fā)生移植排擠和壞死反響。比文獻(xiàn)報(bào)道的應(yīng)用無(wú)細(xì)胞膀胱基質(zhì)厚約0.3進(jìn)展膀胱替代吸收要早，炎性反響要細(xì)微。說(shuō)明HAA組織相容性好，降解吸收快速完全且排擠反響細(xì)微。雖然A、B兩組在膀胱容量上沒(méi)有顯著性差異，但組織學(xué)顯示應(yīng)用Ss/HAA復(fù)合物修補(bǔ)的