人脫細胞羊膜負載大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞構建組織工程膀胱的研究

1、人脫細胞羊膜負載大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞構建組織工程膀胱的研究【摘要】目的討論人脫細胞羊膜Huanaellularanitiebrane，HAA負載大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Ss)進展膀胱替代修復的可能性。方法用去污劑洗滌和酶消化方法制備HAA。將大鼠Ss在體外培養(yǎng)、擴增、傳代。取第4代干細胞用1%二甲亞砜DS預誘導8h，然后應用膀胱勻漿上清液誘導7d。將誘導分化后的Ss接種于HAA外表進展短暫體外培養(yǎng)，獲得組織工程膀胱。將雄性大鼠60只隨機分為3組，行半膀胱切除術，然后分別采用負載干細胞后的HAAA組、HAAB組以及單純縫合組的方法進展修補，每組20只。分別于術后2、4、8測定膀胱容量、進展膀胱造影

2、并取材觀察組織再生情況。結果去污劑洗滌結合酶消化法能有效去除人羊膜中的細胞成分，光鏡及電鏡觀察無細胞成分殘留，細胞相容性好。大鼠膀胱重建術后，A、B兩組與組膀胱最大容量(Vlax)比擬有極顯著性差異P0.01，而A、B兩組之間膀胱最大容量比擬無顯著性差異P0.05。組織學觀察，2時HAA即已吸收降解，膀胱移行細胞和平滑肌細胞開場形成，A組吻合修補區(qū)較厚，平滑肌細胞規(guī)那么且豐富。結論HAA作為膀胱移植物進展膀胱修補吸收降解迅速，負載Ss后構建的組織工程膀胱是理想的替代修補材料。【關鍵詞】膀胱；移植；脫細胞羊膜；生物醫(yī)學工程最早應用組織工程學原理進展組織工程膀胱構建的是akefrest大學醫(yī)學院再

3、生醫(yī)學研究所的Atala等人，他們于1998年進展了同種異體狗再造膀胱的實驗研究1。目前組織工程學技術的研究主要集中在二個方面：支架材料的研究與開發(fā)；種子細胞的培養(yǎng)和植入受損的組織，使其功能得到恢復。膀胱無細胞基質(zhì)和小腸黏膜下層是目前報道最多的組織工程膀胱支架材料。羊膜是一種天然高分子生物材料，來源廣泛，不違犯倫理。本研究采用化學去污劑和酶消化的方法去除新穎羊膜中的細胞成分，保存細胞外基質(zhì)，制備人脫細胞羊膜HAA作為支架材料，并以大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Ss)為種子細胞構建了組織工程膀胱，討論異種來源的HAA作為生物支架材料構建組織工程膀胱的可行性。1材料與方法1.1實驗材料1.2種子細胞培養(yǎng)1

4、.2.1SD大鼠Ss的別離與原代培養(yǎng)21.2.2大鼠膀胱勻漿上清液對Ss的誘導分化8周齡大鼠4只，無菌取其膀胱，立即用PBS液沖洗，勻漿、離心，取上清液用0.2的針頭濾器過濾。取第4代Ss以2104/l密度接種于預置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2d，使細胞貼壁。吸出培養(yǎng)基，換入含有1%DS的培養(yǎng)基預誘導8h，然后換入膀胱勻漿上清液與DE為11的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)7d。期間換液1次。1.2.3培養(yǎng)細胞免疫細胞化學染色鑒定及純度計算1.3HAA制備1.3.1羊膜的選材1.3.2HAA細胞毒性測定按照文獻3要求制備HAA浸提液；取誘導分化的Ss按1104細胞/孔接種于96孔板，正常培養(yǎng)基組為對照組，浸提液組

5、為實驗組；TT法測定吸光度A值，計算細胞相對增殖率RGR,RGR實驗組A值/對照組A值，并對材料毒性評分4。1.4組織工程膀胱的構建1.4.1Ss接種誘導分化后的Ss以2104/l密度接種于預置22HAA的6孔培養(yǎng)板中后加培養(yǎng)基2l。置37、5%2培養(yǎng)箱內(nèi)，在飽和濕度條件下復合培養(yǎng)。1.4.2Ss/HAA復合物顯微鏡檢查收獲培養(yǎng)36h的Ss/HAA復合物，HE染色光鏡及掃描電鏡檢查。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.5大鼠膀胱修復重建實驗1.5.1大鼠膀胱重建1.5.2術后膀胱檢測分別于術后2、4、8時，每組取5只動物處死。處死前測定膀胱最大容積(Vlax)。方法是將膀胱排空，用注射器經(jīng)細尿管嬰幼兒輸

6、液器向膀胱注入生理鹽水，尿道外口有尿液滴出時注入的水量即為Vlax。解剖觀察膀胱大體形態(tài)，并根據(jù)標記線取材固定，HE染色后光鏡下觀察組織學變化。第8周時各組動物進展膀胱造影后再進展前述處理。1.6統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用xs表示,組間比擬采用t檢驗。2結果2.1種子細胞培養(yǎng)2.2HAA檢測將經(jīng)物理和酶處理的HAA做HE染色，置光學顯微鏡下觀察，可見大量淺紅色膠原纖維未受損，無藍染核物質(zhì)，外表沒有殘留的細胞碎屑。掃描電鏡下HAA外表粗糙，一面為網(wǎng)狀纖維構造，孔隙較多，大小不一。兩面均無細胞殘留(圖1)。HAA浸提液組細胞平均相對增殖率為88%，毒性評分為級表1，證明所制備的HAA組織相容性好，符合生物

7、材料應用要求。表1細胞相對增殖率和細胞毒性分級(略)2.3組織工程膀胱構建復合培養(yǎng)36h后HE染色觀察可見HAA材料上生長的細胞，部分融入支架材料內(nèi)；掃描電鏡下可見Ss生長良好，且有突起伸出固定于周圍支架材料圖1。2.4大鼠重建膀胱的大體觀察及容量測定A、B、三組術后1內(nèi)分別死亡5只、4只和1只，均死于尿外滲和膀胱周圍感染。另外A、B兩組均有一只動物有明顯尿外滲腹腔腫大，但未死亡，后尿外滲逐漸好轉(zhuǎn)。術后2時重建膀胱被大網(wǎng)膜包繞，仔細別離后可見標記線內(nèi)膀胱已愈合良好，但較薄，不能識別出HAA。4、8時仍可見部分黏連，A、B兩組膀胱已達正常膀胱外觀，組膀胱明顯縮小，部分黏連比A、B兩組細微。2時A

8、組大鼠膀胱的Vlax為(1.210.60)l，B組為(1.120.53)l，兩組比擬無統(tǒng)計學意義P0.05，組(0.750.41)l,與A、B兩組比擬均有顯著差異(P0.05)。隨時間延長，4、8時大鼠的膀胱容量略有增加但兩組仍無差異。8時膀胱造影見A、B兩組重建的膀胱與正常膀胱相似，組膀胱明顯縮小表2、圖2。2.5重建膀胱的組織學觀察A組和B組術后2時HAA修復區(qū)已有上皮細胞和膀胱平滑肌細胞形成，但B組平滑肌和上皮層較薄，平滑肌不規(guī)那么，A組那么上皮層和平滑肌略厚，相對規(guī)那么。兩組均有嗜酸細胞和淋巴細胞等炎性細胞浸潤圖3；4和8時兩組已經(jīng)與正常膀胱組織無明顯區(qū)別。組2時切口區(qū)僅細微炎性細胞浸

9、潤，無其他異常。表2手術各組術后不同時間Vlax的測定結果略3討論組織工程學是近年來新興起的一門學科，受到了科學界的廣泛關注。其核心是利用組織工程學技術與生命科學的成果，將活細胞與生物材料結合，修復、重建、維持、恢復或進步人體組織的功能5。組織工程的理想支架材料應該具備如下條件：有良好的組織相容性；生物可降解性；無免疫原性；具有多孔性和高空隙率，利于細胞的貼附和生長，誘導組織再生；可塑性；有一定機械強度。而HAA作為一種天然細胞外基質(zhì)生物材料，幾乎具備以上各種生物特性，最有可能在組織體內(nèi)完全再生，并可負載細胞生長。eller6將結膜細胞種植于羊膜上，BrdU標記后植入無胸腺鼠皮下，植入后14d

10、可以追蹤到84%的標記細胞，同時其他指標也顯示黏附于羊膜上的細胞具有干細胞特點，說明羊膜為干細胞提供了有利環(huán)境。本實驗應用去污劑洗滌和酶消化的方法獲得HAA，經(jīng)過光鏡和電鏡檢查，完全去除了細胞碎屑，降低了細胞免疫原性，又不損害HAA的膠原成分，采用TT法進展了細胞相對增殖性測定，細胞相對增殖率80%，細胞毒性級，符合生物材料的應用要求，因此是理想的支架材料。Ss與HAA在體外短暫培養(yǎng)2436h即可完成體外組織工程膀胱的構建，掃描電鏡檢查可見細胞黏附固定在支架材料上。重建膀胱的組織學顯示，2時HAA移植物即已降解吸收，移行上皮和膀胱平滑肌開場形成。無論單獨使用HAA還是使用Ss/HAA復合物進展膀胱替代，均沒有發(fā)生移植排擠和壞死反響。比文獻報道的應用無細胞膀胱基質(zhì)厚約0.3進展膀胱替代吸收要早，炎性反響要細微。說明HAA組織相容性好，降解吸收快速完全且排擠反響細微。雖然A、B兩組在膀胱容量上沒有顯著性差異，但組織學顯示應用Ss/HAA復合物修補的