中藥制劑分析第四章含量測定課件

1、中藥制劑分析第四章含量測定中藥制劑分析第四章含量測定【目的要求】掌握中藥制劑含量測定的樣品前處理方法及測定方法的效能指標(biāo)。掌握可見-紫外分光光度法、TLCS、HPLC、 GC在中藥制劑分析中的應(yīng)用。熟悉熒光分光光度法及原子吸收光度法在中藥制劑分析中的應(yīng)用。了解雙波長、三波長、差示、導(dǎo)數(shù)光譜法在中藥制劑分析中的應(yīng)用。藥物分析學(xué)科【目的要求】藥物分析學(xué)科1 樣品的處理樣品處理的主要作用釋放被測組分，制成穩(wěn)定試樣除去雜質(zhì)，純化濃縮試樣形式符合測定的要求一、樣品的粉碎目的取樣均勻，提取完全粉碎設(shè)備粉碎機、研缽、勻漿機 粒度大小合適，全部過篩 防止污染或損失藥物分析學(xué)科1 樣品的處理樣品處理的主要作用藥

2、物分析學(xué)科1 樣品的處理樣品處理的主要作用釋放被測組分，制成穩(wěn)定試樣除去雜質(zhì)，純化濃縮試樣形式符合測定的要求一、樣品的粉碎目的取樣均勻，提取完全粉碎設(shè)備粉碎機、研缽、勻漿機 粒度大小合適，全部過篩 防止污染或損失藥物分析學(xué)科1 樣品的處理樣品處理的主要作用藥物分析學(xué)科1 樣品的處理二、樣品的提?。ㄒ唬├浣ú僮鳎簶悠肪芊Q定置容器內(nèi)精密加入溶劑稱定重量 浸泡（1224h）稱重補足重量測定測定方法：全部測定法：過濾濾液蒸干定容測定（低濃）部分測定法：過濾濾液取若干體積進行測定（高濃）優(yōu)缺點及適用范圍：操作簡便，適用于熱不穩(wěn)定的樣品，提取雜質(zhì)較少，但是費時，費溶劑藥物分析學(xué)科掌握每種提取方法的操作

3、、優(yōu)缺點及應(yīng)用范圍1 樣品的處理二、樣品的提取藥物分析學(xué)科掌握每種提取方法的1 樣品的處理二、樣品的提?。ǘ┗亓魈崛》ú捎没亓餮b置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴上加熱提取優(yōu)缺點及適用范圍：提取效率高，提取時間短，為0.52小時；提取雜質(zhì)較多，不適用于熱不穩(wěn)定或具有揮發(fā)性的成分（三）連續(xù)回流提取用索氏提取裝置，少用混合溶劑，其余操作同回流提取法。 優(yōu)缺點及適用范圍：提取效率高，所需溶劑少，提取雜質(zhì)較少操作簡便；不適用于受熱易分解的成分。藥物分析學(xué)科1 樣品的處理二、樣品的提取藥物分析學(xué)科1 樣品的處理二、樣品的提取（四）超聲提取法樣品置容器中，加入提取溶劑，放入超聲振蕩器中進行提取 優(yōu)缺點及適用

4、范圍：提取效率高，速度快30min；超聲波可引起化學(xué)成分的改變 （五）超臨界流體提取法（SFE）優(yōu)點：速度快、萃取效率高、方法準(zhǔn)確度高、選擇性高、節(jié)省溶劑、易于自動化，而且可避免使用易燃，有毒的有機溶劑，能與色譜和光譜等分析儀器直接聯(lián)用 藥物分析學(xué)科1 樣品的處理二、樣品的提取藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（1）沉淀法樣品+沉淀劑 沉淀過濾濾液測定 沉淀重量法或溶解后測定藥物分析學(xué)科處理樣品的核心復(fù)方益母草口服液中水蘇堿的含量測定利用雷氏鹽（硫氰酸鉻銨）作沉淀劑，在酸性介質(zhì)中可與大部分有機堿生成難溶于水的配合物與其它雜質(zhì)分離。 1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科處理樣品

5、的核心1 樣品的處理三、樣品的分離純化（2）蒸餾法適用于具揮發(fā)性的待測組分，如揮發(fā)油、小分子的生物堿、丹皮酚等最常用的水蒸氣蒸餾法：共水蒸餾法通水蒸氣蒸餾法水上蒸餾法利用鹽析作用，提高蒸餾效果藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（3）液-液萃取法直接萃取法萃取劑的選擇：親脂性有機溶劑，如苯、氯仿或乙醚； 弱親脂性的溶劑，如乙酸乙酯、正丁醇等多次萃取（3-4次）調(diào)整水相酸度，提取有機酸、有機堿利用鹽析作用，提高提取率藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（3）液-液萃取法離子對萃取法 BH+ I

6、n- BH+In-（水相） BH+In-（有機相） 適合于高度電離的有機酸、堿化合物的萃水相酸度的控制離子對試劑的選擇有機溶劑的選擇藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（4）色譜法（層析法）分離原理：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜操作方式：柱色譜、薄層色譜、紙色譜裝柱方法：濕法裝柱、干法裝柱操作程序：柱的活化；上樣；清洗；洗脫。微柱色譜（固相萃?。┲盍希汗枘z、氧化鋁、氧化鎂、活性炭、聚酰胺、大孔硅 藻土、離子交換樹脂、鍵合相硅膠C8、C18等 藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純

7、化（4）色譜法（層析法）硅膠：酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析，強烈保留堿性化合物洗脫順序：極性小大氧化鋁：弱堿性，分離一些堿性中草藥成分，不宜用于醛、酮、酸、內(nèi)酯等類型的化合物分離中性氧化鋁、酸性氧化鋁：適用于中性、酸性成分的分離鍵合相硅膠（C18或ODS）：分開脂溶性和水溶性成分洗脫順序：極性大小藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（4）色譜法（層析法）大孔樹脂：分為極性（丙烯酰胺聚合物 ）和非極性（苯乙烯和二乙烯苯的共聚物）型非極性型（XAD-2等）：分開脂溶性和水溶性成分 使用前需要用有機溶劑除去雜質(zhì)，有時還需用酸、堿清洗 聚酰

8、胺：與溶質(zhì)形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用，常用于含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離硅藻土、纖維素：以水基質(zhì)液作為固定相，與水不混溶的有機溶劑為流動相的分配色譜藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（4）色譜法（層析法）離子交換樹脂：用于除去樣品中的離子及萃取可離解化合物(弱酸、弱堿藥物)（5）固相微萃取（SPME）集萃取、濃縮、進樣于一體的樣品前處理新方法藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（6）消化法-測定中藥制劑中的無機元素目的：破壞有機物，使無機物游離濕法消化：硝酸-高氯酸法：適用于血，尿、組織

9、等生物樣品和含動植物藥制劑的破壞，無機金屬離子均為高價態(tài)。 對含氮雜環(huán)類有機物破壞不夠完全。 硝酸-硫酸法：適用于大多數(shù)有機物的破壞。 與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測定，不宜采有此法。 硫酸-硫酸鹽法：常用于含砷或銻的有機樣品的破壞，破壞后得到三價砷或銻。藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科1 樣品的處理三、樣品的分離純化（6）消化法-測定中藥制劑中的無機元素目的：破壞有機物，使無機物游離干法消化：供試品 灰分 控制溫度在420以下不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等，）有機樣品的破壞。如果灰化不完全，可以加入硝酸-水（1：3）或稀鹽酸-水（1：3）水浴上蒸干后，繼續(xù)小

10、火灰化藥物分析學(xué)科灼燒灰化(+NaCO3/MgO)1 樣品的處理三、樣品的分離純化藥物分析學(xué)科灼燒灰化(+N2 含量測定方法的驗證需驗證的分析項目1. 鑒別試驗；2. 雜質(zhì)定量或限度檢查；3. 原料或制劑中有效成分含量測定；4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定；5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證需驗證的分析項目藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證一、準(zhǔn)確度是指以測得結(jié)果與真實值之間的接近程度。由于真實值是未知的，故常用回收率試驗來表示。二、精密度是指一種均勻樣品經(jīng)多次取樣重復(fù)分析后，各次結(jié)果之間的符合程度。常用標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏

11、差表示。重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證一、準(zhǔn)確度藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證1. 重復(fù)性 在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度；在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次；或把被測物濃度當(dāng)作100%，至少測6次進行評價。2. 中間精密度 同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度?？疾祀S機變動因素的影響。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備。3. 重現(xiàn)性 不同實驗室，不同分析人員測定結(jié)果的精密度。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時，應(yīng)進行重現(xiàn)性試驗。如建立藥典分析方法時通過協(xié)同檢驗得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)

12、同檢驗的過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證1. 重復(fù)性 在相同條件下，由同一2 含量測定方法的驗證三、專屬性是指在樣品中存在干擾成分的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確，專一地測定分析物的能力。四、檢測限檢測限是指在規(guī)定的實驗條件下，分析方法能夠檢測（但不需要定量）樣品中分析物的最低濃度。1非儀器分析目視法用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。2. 信噪比法藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證三、專屬性藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證五、定量限是指在規(guī)定的實驗條件下和具有可接受的精密度和準(zhǔn)確度前提下，分析方法能夠測定樣品中分析物的最低濃度。六、線

13、性七、范圍八耐用性是指測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的程度為常規(guī)檢驗提供依據(jù)。衡量方法不受參數(shù)微小變差影響的能力。藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證五、定量限藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證分析方法效能指標(biāo)的要求1、用于鑒別試驗：只對專屬性、耐用性二項指標(biāo)有所要求，其余均無須要求2、雜質(zhì)測定或制劑中降解物測定：當(dāng)用于定量除檢測限不必要求外，其余七項指標(biāo)均應(yīng)有所要求；用于限度檢查只對專屬性、檢測限、和耐用性有要求。3、用于原料藥中主成分或制劑中有效成分含量測定及溶出度測定，除了檢測限和定量限外，其余均要求。藥物分析學(xué)科2 含量測定方法的驗證分析方法效能指標(biāo)的要求藥物分析學(xué)科3 常用定量

14、分析方法一、化學(xué)分析法適用于含量較高的成分及無機成分的測定（一）重量分析揮發(fā)法：如水分測定萃取法：如冰片散中冰片的含量測定沉淀法：如苦參片中苦參總堿的含量測定3 常用定量分析方法一、化學(xué)分析法3 常用定量分析方法一、化學(xué)分析法（二）滴定分析酸堿滴定法：、內(nèi)酯類 沉淀滴定法測定生物堿、有機酸銀量法：生物堿的氫鹵酸鹽及有機鹵化物四苯硼鈉法：+生物堿白色沉淀配位滴定法（EDTA法和硫氰酸銨法）：測定鞣質(zhì)、生物堿及Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量氧化還原滴定法：酚類、糖類及礦物藥中Fe、As等3 常用定量分析方法一、化學(xué)分析法3 常用定量分析方法二、可見-紫外分光光度法（一）單

15、波長分光光度法1、吸收系數(shù)法（CHP最為常用）例題左金丸的含測 A=ECL（百分吸收系數(shù)，單位g/100ml） 朗伯-比爾定律：物質(zhì)對單色光吸收特性與濃度、液層厚度關(guān)系定律 2、對照品比較法 對照品溶液濃度應(yīng)與供試品濃度接近（10010）3、標(biāo)準(zhǔn)曲線法3 常用定量分析方法二、可見-紫外分光光度法3 常用定量分析方法二、可見-紫外分光光度法（二）計算分光光度法1、雙波長分光光度法系數(shù)倍率法等吸收點法2、三波長分光光度法討論：計算分光光度法在中藥及其制劑中的應(yīng)用前景3 常用定量分析方法二、可見-紫外分光光度法雙波長分光光度法 在單位時間內(nèi)有兩條波長不同的光束1和2交替照射同一個溶液，由檢測器測出的

16、吸收度是這兩個波長下吸收度的差值A(chǔ)。A與被測定物質(zhì)的濃度成正比，這個方法稱雙波長分光光度法。雙波長分光光度法的關(guān)鍵是正確選擇兩波長1、2，要求被測組分D在兩波長處的A足夠大，而干擾組分G和背景在兩波長應(yīng)有相同的吸光度(A=0)。為滿足上述要求，一般是將2選在待測組分的最大吸收波長，1是選在干擾組分等吸收波長。此法可測定渾濁樣品，也可測定吸收光譜相互重疊的混合物樣品，也是當(dāng)雜質(zhì)使主峰產(chǎn)生肩峰時測定主峰物質(zhì)的較好定量方法。雙波長分光光度法 在單位時間內(nèi)有兩條波長不同的光束三波長分光光度法選定的三個波長在干擾物質(zhì)的吸收光譜上應(yīng)為一條直線。在三波長處分別測定混合物的吸光度A1、A2、A3，根據(jù)相似三角

17、形的等比特性，可得下式：E1、E2、E3分別為待測組分在三個波長處的吸光系數(shù)，L為光程，Cx為待測組分濃度。m=2-3，n=1-2，可見A只與待測組分濃度有關(guān)。本法可有效消除干擾組分對待測組分測定的干擾，尤其適用于渾濁樣品分析。但三波長選擇及結(jié)果計算較為費時。目前已有些紫外儀器裝備了專用程序，自動完成三波長法的運算。A=A1-K（A2+A3)三波長分光光度法選定的三個波長在干擾物質(zhì)的吸收光譜上應(yīng)為一條3 常用定量分析方法三、薄層掃描法TLCS（一）薄層吸收掃描法光源：氘燈(190-340nm)和W燈(340-900nm 薄層板引起的散射現(xiàn)象（散射系數(shù)SX）標(biāo)準(zhǔn)曲線（Kubella-Munk曲線

18、）彎曲校正（曲線校直法和計算機回歸法）（二）薄層熒光掃描法光源：汞燈(250-580nm)直線式掃描，無需曲線校直藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法三、薄層掃描法TLCS藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法三、薄層掃描法TLCS（三）定量分析方法1、方法學(xué)考察工作曲線：檢查所選散射參數(shù)SX是否適宜；考察工作曲線是否過原點，以便確定是用外標(biāo)一點法還是二點法測定；確定點樣量的線性范圍。 分離度：R1.0重復(fù)性考察：RSD3%準(zhǔn)確度考察：95%105%2、定量方法（討論常用定量方法）外標(biāo)法：一點法、兩點法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法內(nèi)標(biāo)法藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法三、薄層掃描法TLCS藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方

19、法三、薄層掃描法TLCS健脾丸中熊果酸的含量測定含量測定 取小蜜丸或重量差異項下的大蜜丸，剪碎，混勻，取約4g，精密稱定，加水30ml，放置使溶散，濾過，殘渣用水30ml洗滌，在室溫干燥至呈松軟粉末狀或低溫干燥后研細，連同濾紙一并置索氏提取器內(nèi)，加乙醚適量，加熱回流提取4小時，提取液回收乙醚至干，殘渣用石油醚（3060）浸泡兩次，每次10ml（浸泡約2分鐘），傾去石油醚，殘渣加適量三氯甲烷-無水乙醇（2:3）混合液使溶解，轉(zhuǎn)移至2ml量瓶內(nèi)，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取熊果酸對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄VI B）

20、試驗，精密吸取供試品溶液4ul與6ul，對照品溶液2ul與4ul，分別交叉點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:5:8:0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105加熱至斑點顯色清晰，取出，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定，進行掃描，波長S=540nm，R=700nm，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計算，即得。本品含山楂以熊果酸（C30H48O3）計，小蜜丸每1g不得少于0.10mg；大蜜丸每丸不得少于0.90mg。藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法三、薄層掃描法TLCS藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法四、氣相色譜

21、法GC（一）應(yīng)用范圍揮發(fā)油及其它揮發(fā)性組分：冰片、桉葉素、樟腦、丁香酚、龍腦等中藥制劑含水量、含醇量（二）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗理論塔板數(shù) n5.54(tR/W1/2)2 最小理論塔板數(shù)，柱長，柱填充、載體性能等有影響分離度 R=2(tR1-tR2)/(W1+W2) R1.5（兩峰完全分離）重復(fù)性，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD2.0 (n=5)拖尾因子T=W0.05h/2d1 (d1峰極大至峰前沿之間的距離) 1.05T0.95藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC藥物分析學(xué)科樣品沸點范圍柱溫固定相配比300400 200250 15% 200300 150180 510% 100200 各組分的平

22、均沸點2/3左右 1015% 氣體等低沸點樣品 室溫或50下 1525% 3 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC（三）實驗條件的選擇1、固定相的選擇氣固色譜硅膠、石墨、化學(xué)鍵合相、高分子多孔微球等氣液色譜烴類、硅氧烷類、醇類、酯類，特殊固定液（手性）2、柱溫的選擇藥物分析學(xué)科寬沸程樣品：程序升溫法樣品沸點范圍柱溫固定相配比300400 2002503 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC（三）實驗條件的選擇3、載氣的選擇H2、He：流速大，柱長，熱導(dǎo)檢測器N2：流速小，氫焰檢測器，電子捕獲檢測器 流速：2080ml/min4、其它條件的選擇進樣方式：直接進樣、頂空進樣（兼有分離分析作用）進樣口（

23、汽化室）溫度：樣品的沸點或稍高于沸點，30/ 50+T柱T汽 50+T沸點檢測室溫度：30+T柱T檢T汽藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC（三）實驗條件的選擇4、其它條件的選擇進樣時間：1秒以內(nèi)進樣量：理論允許最大進樣量使下降的塔板數(shù)不超過10。氣體：0.11ml；液體：0.1-1l分流器分流進樣：1/101/100檢測器：TCD, FID, NPD, ECD藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC（四）含量測定方法（例題見P84）1、內(nèi)標(biāo)法加校正因子 求算校正因子 待

24、測組分含量測定2、外標(biāo)法3、面積歸一化法4、標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法四、氣相色譜法GC藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法五、高效液相色譜法HPLC（一）特點分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣（二）適用范圍揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化合物及離子型化合物，如蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、甾體、類脂、核酸、維生素及無機鹽類 （三）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法五、高效液相色譜法HPLC藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法五、高效液相色譜法HPLC（四）實驗條件的選擇色譜柱的選擇（固定相的選擇） 流動相的選擇優(yōu)級純或色譜純，脫氣，過濾（0.45m）部分含水溶劑：適

25、用于分離中等極性、弱極性藥物非水溶劑：分離疏水性物質(zhì) 緩沖溶液：適用于可溶于水并具可解離特性的化合物，如蛋白質(zhì)、肽及弱酸、弱堿類化合物。 洗脫方式：等度洗脫與梯度洗脫檢測器：UVD, FD, ELSD, ECD,RID 藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法五、高效液相色譜法HPLC藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法五、高效液相色譜法HPLC（五）含量測定方法1、外標(biāo)法2、內(nèi)標(biāo)法3、內(nèi)加法4、歸一化法 例題P90藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法五、高效液相色譜法HPLC藥物分析學(xué)科3 常用定量分析方法六、熒光分析法（一）基本原理（二）適用范圍胺類、甾體、蛋白質(zhì)、氨基酸、酶（三）測定方法直接熒光法、制備熒光法、化學(xué)引導(dǎo)熒光法、熒光淬滅法、膠束增敏熒光法（四）優(yōu)缺點靈敏度高（10101012g/ml）選擇