流式細(xì)胞術(shù)在科研中的應(yīng)用描述課件

1、 流式細(xì)胞術(shù)在科研(k yn)中 的應(yīng)用 第一頁(yè)，共五十五頁(yè)。什么(shn me)是流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀實(shí)物(shw)BD FACSVantageBD-Calibur 第二頁(yè)，共五十五頁(yè)。流式細(xì)胞(xbo)儀可檢測(cè)到的細(xì)胞(xbo)參數(shù)非熒光(ynggung)信號(hào)顆粒(kl)度細(xì)胞大小前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性第三頁(yè)，共五十五頁(yè)。外周全(zhuqun)血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖第四頁(yè)，共五十五頁(yè)。熒光(ynggung)信號(hào)熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長(zhǎng)(bchng)不

2、同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽(yáng)）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測(cè)出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個(gè)或三個(gè)激光光源（488nm、633nm和325nm），可測(cè)出6個(gè)FL。第五頁(yè)，共五十五頁(yè)。熒光(ynggung)信號(hào)雙色直接(zhji)染色第六頁(yè)，共五十五頁(yè)。流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。幾個(gè)概念：%Gated：陽(yáng)性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測(cè)物質(zhì)(wzh)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一

3、般用該值。Geo Mean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽(yáng)性細(xì)胞為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。第七頁(yè)，共五十五頁(yè)。散點(diǎn)圖 密度(md)圖二維等高圖直方圖圖 報(bào)告(bogo)中常見的幾種流式細(xì)胞圖第八頁(yè)，共五十五頁(yè)。圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記(bioj)分析細(xì)胞凋亡和壞死第九頁(yè)，共五十五頁(yè)。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖分析(fnx)第十頁(yè)，共五十五頁(yè)。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析(fnx)第十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。圖中100101（M1）為陰性(ynxng)細(xì)胞，101以上的（M2）為陽(yáng)性細(xì)胞 第十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。當(dāng)前(dngqin)流式細(xì)胞分析發(fā)展趨勢(shì)從相對(duì)(xingdu)細(xì)胞計(jì)數(shù)到絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù) 從相對(duì)定量

4、到絕對(duì)定量分析從單色到多色熒光分析 從細(xì)胞膜成分到細(xì)胞內(nèi)成分分析從細(xì)胞分析到可溶性成分的流式細(xì)胞分析 第十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。今天主要(zhyo)內(nèi)容：流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中的應(yīng)用(yngyng)流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤細(xì)胞DNA倍體中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的分選功能流式細(xì)胞術(shù)在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用第十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞(xbo)凋亡檢測(cè)第十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。1、半胱氨酸蛋白酶3檢測(cè)法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）3、Apo2.7檢測(cè)法（早期）4、TUNEL 法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細(xì)胞凋亡相關(guān)(xinggun)蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(jin

5、c)細(xì)胞凋亡第十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞(xbo)凋亡的分析細(xì)胞凋亡的主要(zhyo)表現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水解酶改變：如Caspase-3活化細(xì)胞膜不對(duì)稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI細(xì)胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實(shí)驗(yàn)（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2第十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞(xbo)凋亡Active Caspases-3第十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞(xbo)凋亡Caspases-3第十九頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞(xbo)凋亡Annexin 第二十頁(yè)，共五十五頁(yè)。凋亡(dio wn)檢測(cè)（Annexin V/PI法） PIA

6、nnexin V-FITC第二十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。DNA倍體的流式分析(fnx)第二十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞DNA含量(hnling)檢測(cè)細(xì)胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，可測(cè)出細(xì)胞的DNA含量(hnling)。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測(cè)。 第二十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。第二十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。單參數(shù)(cnsh)直方圖圖中2N代表(dibio)G0/G1期細(xì)胞，4N代表(dibio)G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表(dibio)S期細(xì)胞。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式D

7、NA圖 第二十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。DNA細(xì)胞周期分析(fnx)細(xì)胞周期G2MG0G1s 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA分析(fnx)DNA含量(hnling)細(xì)胞數(shù)量2N4N第二十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。第二十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。2倍體異倍體4倍體腫瘤(zhngli)組織中的各種DNA倍體第二十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。含量(hnling)與凋亡關(guān)系DNA亞G1峰的檢測(cè)：利用PI染色，檢測(cè)具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備(zhbi)中的固定處理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段

8、從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第二十九頁(yè)，共五十五頁(yè)。第三十頁(yè)，共五十五頁(yè)。第三十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 圖 FCM測(cè)試細(xì)胞(xbo)周 期分布和凋亡第三十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。流式細(xì)胞(xb

9、o)儀的細(xì)胞(xbo)分選功能第三十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。分選：用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國(guó)內(nèi)較少，臺(tái)式機(jī)一般(ybn)分選速度為每秒鐘300個(gè)細(xì)胞，大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞第三十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第三十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。流式分選與分子生物學(xué)研究(ynji)除了將分選得到的細(xì)胞(xbo)進(jìn)行后續(xù)

10、培養(yǎng)研究外，F(xiàn)CM分選系統(tǒng)可為PCR、FISH等分子技術(shù)提供純度較高的特異性細(xì)胞(xbo)群，減少研究中的干擾因素，獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第三十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋白定量(dngling)技術(shù)第三十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。導(dǎo)言(doyn)常規(guī)的蛋白分析方法：ELISA：一次反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)Western blot：不能對(duì)蛋白精確定量不足之處：檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)需耗費(fèi)大量樣本分批操作導(dǎo)致組間差異大操作繁瑣(fn su)，耗時(shí)耗力如何能夠從單個(gè)微量樣本中一次檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白，并加以定量，獲得高精確度的數(shù)據(jù)呢？針對(duì)于此，BD-Pharmin

11、gen成功研發(fā)了基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)平臺(tái)的液相多重蛋白定量技術(shù)BD Cytometric Bead Array，簡(jiǎn)稱CBA 第三十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。CBA技術(shù)(jsh)簡(jiǎn)介CBA是一系列帶有不同強(qiáng)度紅色熒光、包被有捕獲抗體的微球，類似(li s)ELISA的捕獲孔板，可以捕獲液相樣本（血清、血漿或者細(xì)胞培養(yǎng)上清液等）中相應(yīng)的抗原，再結(jié)合PE標(biāo)記檢測(cè)抗體，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，便可同時(shí)對(duì)樣本中的多種可溶性蛋白成分進(jìn)行定量+Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbBead第三十九頁(yè)

12、，共五十五頁(yè)。BD Cytometric Bead Array123不同(b tn)強(qiáng)度紅色熒光的捕獲微球，在FCM FL3檢測(cè)不同的目標(biāo)(mbio)蛋白PE 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，在FCM FL2檢測(cè)。 PE的熒光(ynggung)強(qiáng)度即反映靶蛋白的含量456第四十頁(yè)，共五十五頁(yè)。Human Th1/Th2 Lymphokine CBATh1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TNF, IFN用 FL3熒光的強(qiáng)度(qingd)不同區(qū)別 種不同的微球（beads）Direct sandwich immunoassayFL2 (PE) detector reagent樣本

13、處理6 cytokines from a 50 L sampleThree pipetting steps3 hour total incubationQuantitative results and complete report generationSoftware assisted quantitative analysis, with curve fitting algorithmResult reporting included in software第四十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。Human Th1/Th2 Lymphokine CBA第四十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。 Chemokine-I CB

14、A Assay Standard0 pg/mlCBA Assay Standard 第四十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。10 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。20 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。40 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。80 pg/mlCBA Assay Standa

15、rd cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。156 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。312 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十九頁(yè)，共五十五頁(yè)。625 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十頁(yè)，共五十五頁(yè)。1250 pg/mlCBA Assay Standa

16、rd cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。2500 pg/mlCBA Assay Standard cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。Human Th1/Th2 Lymphokine CBA 標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-第五十三頁(yè)，共五十五頁(yè)?？偨Y(jié)(zngji)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的是處于流動(dòng)狀態(tài)中的被熒光素標(biāo)記的微粒，包括細(xì)胞、細(xì)菌或者微球。對(duì)于可溶性抗原，只能用相應(yīng)的抗體(kngt)先包被微球，再來結(jié)合抗原進(jìn)行檢測(cè)。流式