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1、二章菌種選育保藏與復(fù)壯二章菌種選育保藏與復(fù)壯 第二章 菌種選育、保藏與復(fù)壯 第一節(jié) 工業(yè)常用微生物及要求一、常見微生物 (一)細(xì)菌(bacteria)醋酸桿菌屬(Acetobacter)乳桿菌屬(Lactobacillus)芽孢桿菌屬(Bacillus)短桿菌屬(Brevibacterium)棒桿菌屬(Corynebacterium)第2頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第二章 菌種選育、保藏與復(fù)壯第2頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(二)放線菌(actinomyces)最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于產(chǎn)生多種抗生素(antibiotic)鏈霉菌(Streptomyces)小單孢菌屬(Micromonospora)第3頁(yè),共58頁(yè)
2、幻燈片。(二)放線菌(actinomyces)第3頁(yè),共58頁(yè)幻燈片 (三)霉菌(mould) 1.曲霉屬(Aspergillus) 黑曲霉(A. niger) 米曲霉(A. oryzae) 黃曲霉(A. flavus) 2.青霉屬(Penicillum) 桔青霉(P. citrinum)第4頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 (三)霉菌(mould)第4頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。3. 根霉屬(Rhizopus ) 米根霉(R. oryzae) 華根霉(R. chinensis)4. 紅曲霉屬(Monascus)第5頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。3. 根霉屬(Rhizopus )第5頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(四)酵母(yeas
3、t)酵母屬(Saccharomyces) 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2. 假絲酵母屬(Candida) 產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)3. 畢赤酵母屬(Pichia)第6頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(四)酵母(yeast)第6頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(五)其它微生物1.擔(dān)子菌(basidiomycetes)即菇類(mushroom)2. 藻類(alga)第7頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(五)其它微生物第7頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。幾種菌落第8頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。幾種菌落第8頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 (六)噬菌體(phage) 危害以細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。第9頁(yè),共
4、58頁(yè)幻燈片。 (六)噬菌體(phage)第9頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。烈性噬菌體 引起寄主細(xì)胞迅速裂解。 受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌。溫和噬菌體 隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。 含溫和噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌。第10頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。烈性噬菌體第10頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求1.原料廉價(jià),生長(zhǎng)迅速,目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。2.易控制培養(yǎng)條件,發(fā)酵周期較短。3.抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)。4.不易變異和退化,不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和 毒素。第11頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求第11頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育一、自然選育 1.采樣 2.增殖培養(yǎng) 方法: (1)
5、控制培養(yǎng)基成分 (2)控制培養(yǎng)條件 (3)抑制不需要的菌類第12頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育第12頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。3. 純種分離(1)劃線法:簡(jiǎn)單、快捷。 (2)稀釋法:菌落單一均勻。是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)繁殖成單菌落,通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的,故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。第13頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。3. 純種分離是指把混雜在
6、一起的微生物或同一微生物群體中的不固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法第14頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法第14頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。接種針先以火焰滅菌法滅菌 步驟一第15頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。接種針先以火焰滅菌法滅菌 步驟一第15頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。輕觸營(yíng)養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻 步驟二第16頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。輕觸營(yíng)養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻 步驟二第16頁(yè),共58頁(yè)幻燈以接種針輕觸菌落,使接種針上沾有細(xì)菌。 步驟三第17頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。以接種針輕觸菌落,使接種針上沾有細(xì)菌。 步驟三第17頁(yè),共5更換一個(gè)新的無菌營(yíng)養(yǎng)平板 步驟四第18頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。更換一個(gè)新的無菌營(yíng)養(yǎng)平板 步驟四第1
7、8頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營(yíng)養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū) 。步驟五第19頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營(yíng)養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū) 。步驟重復(fù)第一步驟,將接種針以火焰滅菌法滅菌,然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六第20頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。重復(fù)第一步驟,將接種針以火焰滅菌法滅菌,然后輕觸瓊脂無菌處冷由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū),如右上圖。步驟七第21頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū),如右上圖。步驟七第21頁(yè),共重復(fù)第六以及第七步驟,由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū),如右上圖。 步驟八第22頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。重復(fù)第六以及第七步驟,由第七步驟的步驟八第
8、22頁(yè),共58頁(yè)幻重復(fù)第六以及第七步驟,由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū),劃滿剩下的空間。完成后的營(yíng)養(yǎng)平板,如右上圖。步驟九第23頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。重復(fù)第六以及第七步驟,由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū),劃滿剩 在營(yíng)養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽,標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十第24頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 在營(yíng)養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽,標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法第25頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法第25頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。需要使用的儀器震蕩機(jī) 第26頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。需要使用的儀器震蕩機(jī) 第26頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液第27頁(yè)
9、,共58頁(yè)幻燈片。吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液第27頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。吸取充分均勻后的菌液 第28頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。吸取充分均勻后的菌液 第28頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。取含有 9mL無菌水之試管,將試管口過火滅菌。將菌液置入,此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。第29頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。取含有 9mL無菌水之試管,將試管口過火滅菌。第29頁(yè),共5將試管于震蕩機(jī)上,使菌液混合均勻 第30頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。將試管于震蕩機(jī)上,使菌液混合均勻 第30頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL,加入另一個(gè)新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。 第31頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。取出試管
10、中的第一次十倍稀釋菌液1mL,第31頁(yè),共58頁(yè)幻燈從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL菌液,置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。第32頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL菌液,置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)將三角玻璃棒浸于酒精中 第33頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。將三角玻璃棒浸于酒精中 第33頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 將三角玻璃棒在火焰上燃燒(須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中,引起燃燒) 第34頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 將三角玻璃棒在火焰上燃燒第34頁(yè),共5 使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來,將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目,再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。 第35頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 使用玻璃棒將菌液均勻涂布
11、開來,將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱第36頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第36頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。4. 生產(chǎn)性能的測(cè)定 一般采用兩步法: 初篩:以量為主 復(fù)篩:以質(zhì)為主第37頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。4. 生產(chǎn)性能的測(cè)定第37頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 二、誘變育種 用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變。誘變劑:能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。誘變劑物理:紫外線,快中子化學(xué):硫酸二乙酯,亞硝基胍第38頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 二、誘變育種誘變劑物理:紫外線,快中子化學(xué):硫酸二 誘變育種的主要環(huán)節(jié)(1)以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液 誘變(2)用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株, 選出性能優(yōu)良的正變異株篩選第39頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 誘
12、變育種的主要環(huán)節(jié)第39頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的改良 一、原生質(zhì)體融合(protoplast fusion) 1.標(biāo)記菌株的篩選 2.原生質(zhì)體的制備 3.原生質(zhì)體的融合與再生 聚乙二醇(PEG)脫水劑 助融劑 Ca2+提高融合頻率 4.融合子的選擇原生質(zhì)體,它是細(xì)胞進(jìn)行各類代謝的主要場(chǎng)所,是細(xì)胞中重要的部分。原生質(zhì)體可分為質(zhì)膜、細(xì)胞器、胞基質(zhì)三部分第40頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的改良原生質(zhì)體,它是細(xì)胞進(jìn)行各第41頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第41頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 二、DNA重組技術(shù)(DNA recombination technology)目標(biāo)DNA片斷的獲得與載體DN
13、A分子的連接重組DNA分子引入宿主細(xì)胞從中選出所需重組DNA分子的宿主細(xì)胞第42頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 二、DNA重組技術(shù)第42頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏一、菌種的衰退 衰退的原因:1.菌種保藏不當(dāng)2.菌種生長(zhǎng)條件沒有得到滿足第43頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏第43頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。二、 菌種的復(fù)壯 1. 純種分離 2. 通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯 3. 淘汰已衰退的個(gè)體第44頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。二、 菌種的復(fù)壯第44頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。三、菌種保藏 1.原理 低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 2. 方法 (1)斜面保藏法 (2)干燥保藏法 (3)懸液保藏
14、法 (4)冷凍干燥保藏法 (5)低溫保藏法第45頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。三、菌種保藏第45頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)一、微生物的培養(yǎng)方法 1.表面培養(yǎng) 2.固體培養(yǎng) 3.液體深層培養(yǎng)第46頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)第46頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第47頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第47頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的: 為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。 第48頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)第48頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 (一)種子制備的工藝流程 搖瓶保藏菌種 試管斜面活化 茄瓶斜面 種子罐 固體培養(yǎng)基第49頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。 (
15、一)種子制備的工藝流程第49頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第50頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第50頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第51頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第51頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。搖瓶種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)第52頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。搖瓶種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)第52頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第53頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第53頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第54頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。第54頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(二) 斜面菌種的培養(yǎng) 1.不宜多次移種。 2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。 培養(yǎng)基特點(diǎn):原料較精細(xì)。第55頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(二) 斜面菌種的培養(yǎng)第55頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(三)一級(jí)種子培養(yǎng)(搖瓶)培養(yǎng)基特點(diǎn): 使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。第56頁(yè),共58頁(yè)幻燈片。(三)一級(jí)種子培養(yǎng)
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