內(nèi)蒙古大學(xué)細胞生物學(xué)講義14細胞增殖調(diào)控與癌細胞

1、第十四章 細胞增殖調(diào)控與癌細胞第一節(jié) 細胞增殖調(diào)控一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用1970s，Rao和Johnson發(fā)現(xiàn)：與M期細胞（Hela）融合的間期細胞染色體發(fā)生形態(tài)各異的早熟凝集染色體（prematrely condensed chromosome，PCC），這種現(xiàn)象叫做早熟染色體凝集（prematre chromosome condensation）。G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。不同類的M期細胞均可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，說明M期細胞具有促進間期細胞進行分裂的因子，即成熟促進因子(matrati

2、on promoting factor，MPF)。爪蟾卵子成熟過程MPF的發(fā)現(xiàn)早在1960s，Yoshio Masi發(fā)現(xiàn)成熟蛙卵的提取物能促進未成熟卵的胚胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，后來Snkara將不同時期Hela細胞的提取液注射到蛙卵母細胞中，發(fā)現(xiàn)G1和S期的抽取物不能誘導(dǎo)GVBD，而G2和M期的則具有促進胚胞破裂的功能，它將這種誘導(dǎo)物質(zhì)稱為有絲分裂因子(MF)。后來在CHO細胞，酵母和粘菌中也提取出相同性質(zhì)的MF。這類物質(zhì)被統(tǒng)稱為MPF。1960s，Leland Hartwell，1970s，Paul Nurse分別以芽殖酵母和裂殖酵母為實驗

3、材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細胞分裂有關(guān)的基因（cell division cycle gene，cdc）。如：裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂；Wee1突變型提早分裂，cdc25突變型細胞體積增大而不分裂；cdc2和cdc28都編碼一個34KD的蛋白激酶（p34cdc2，p34cdc28），且屬于同源物，均能促進細胞周期的進行，在調(diào)節(jié)G1/S轉(zhuǎn)化中起作用。但這兩種激酶只有結(jié)合相關(guān)蛋白后，才表現(xiàn)激酶活性。wee1和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進CDC2的活性。1980s，Timothy Hunt發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細胞周期振蕩，命名為周期

4、蛋白(cyclin A和B)。后來發(fā)現(xiàn)各類動物來源的細胞周期蛋白mRNA均能誘導(dǎo)蛙卵的成熟。1988年Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=CDC2+clyclinB，2001年10月8日美國人Leland Hartwell、英國人Paul Nurse、Timothy Hunt因?qū)毎芷谡{(diào)控機理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。CDKCDC2與細胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。CDC2又被稱為CDK1，可將特定蛋白磷酸化，

5、促進細胞周期運行，又稱作細胞周期引擎。如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。在動物中已知7種CDK。均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即 PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。三、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDK inhibitor，CKI）CKI對細胞周期起負調(diào)控作用，阻止Cyclin-Cdk復(fù)合物的裝配或活性；而將細胞阻止在不同的檢驗點。如DNA受損后，細胞將停留于G1 Checkpoint讓DNA修復(fù)或者凋亡；CDI包括 INK4 家族和 CIP/KIP 家族：-Ink4（Inhibitor of cdk4）：P16ink4

6、a，P15ink4b，P18ink4c，P19ink4d。特異性抑制 cdk4cyclin D1，cdk6cyclin D1。-Kip（Kinase inhibition protein）：P21cip1 (cyclin inhibition protein 1）P27kip1、P57kip2，抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。P21cip1還能與DNA聚合酶的輔助因子 PCNA (proliferating cell nclear antigen)結(jié)合，直接抑制DNA的合成。細胞周期蛋白（cyclin）特點：在細胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白

7、與CDK結(jié)合。作用：激活CDK，決定CDK何時、何處、將何種底物磷酸化，從而推動細胞周期的前進。已知30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。四、Cyclin-CDK復(fù)合物的多樣性及細胞周期調(diào)控G1期：在生長因子的刺激下，cyclin D表達，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1 的基因。G1-S期：cyclin E與CDK2結(jié)合，促進細胞進入S期。Cyclin E的抗體能使細胞停滯于G1期。G2-M期：cyc

8、lin A、cyclin B 與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體。M期：M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。其濃度決定于降解的速度；但在大多數(shù)細胞的有絲分裂周期中，cyclin的積累是因為在G2-M期cyclin基因轉(zhuǎn)錄的增強。結(jié)合cyclin B的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC 25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶（CDK activating kin

9、ase，CAK）的作用下完成的。 M期周期蛋白與M/后期轉(zhuǎn)化：在中期當(dāng)MPF活性達到最高時，激活后期促進因子APC（anaphase promoting complex），將泛素連接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細胞周期。分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱降解盒(destruction box)。當(dāng)MPF活性達到最高時，通過泛素連接酶催化泛素與cyclin結(jié)合，cyclin 隨之被26S蛋白酶體水解。G1周期蛋白也通過類似的途徑降解，但其N端沒有降解盒，C端有一段PEST序列與其降解有關(guān)。泛素由76個氨基酸組成，高度保守。共價結(jié)合泛

10、素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。在蛋白質(zhì)的泛素化過程中，E1泛素激活酶水解ATP獲取能量，通過其活性位置的半胱氨酸殘基與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素，然后E1將泛素交給E2泛素結(jié)合酶，最后在E3泛素連接酶的作用下將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。參與細胞周期調(diào)控的泛素連接酶至少有兩類：-其中SCF（skp1-cllin-F-box protein，三個蛋白構(gòu)成的復(fù)合體）負責(zé)將泛素連接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上；-APC負責(zé)將泛素連接到M期周期蛋白上。-APC介導(dǎo)選擇性降解的

11、靶蛋白與泛素結(jié)合（通過泛素依賴性途徑降解）。 -APC主要介導(dǎo)兩類蛋白降解：Anaphase Inhibitors 和 Mitotic Cyclin。前者維持姐妹染色單體粘連，抑制后期啟動；后者的降解意味著有絲分裂即將結(jié)束，即染色體開始去凝集，核膜重建。-Mad2蛋白位于動粒上，在染色體結(jié)合有絲分裂紡錘體前將不斷從動粒上釋放而抑制APC的活性。所以只有所有染色體都與紡錘體結(jié)合后，APC才有活性，才啟動細胞向后期轉(zhuǎn)換。五、細胞周期檢驗點（check point） 細胞要分裂，必須正確復(fù)制DNA和達到一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細胞不可能進行分裂。細胞周期的運行，是在一系列稱為檢驗點的

12、嚴(yán)格檢控下進行的，當(dāng)DNA發(fā)生損傷，復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常，周期將被阻斷。細胞周期檢驗點是細胞周期調(diào)控的一種機制，主要是確保周期每一時相事件的有序、全部完成并與外界環(huán)境因素相聯(lián)系。細胞周期檢驗點由感受異常事件的感受器、信號傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器構(gòu)成。檢驗點主要包括：-G1/S檢驗點：控制細胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細胞外環(huán)境是否適宜？細胞體積是否足夠大？在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點。-S期檢驗點：DNA復(fù)制是否完成？-G2/M檢驗點：是決定細胞一分為二的控制點，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？-中-后期檢驗點：紡錘體組

13、裝檢驗點，任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC的活性，引起細胞周期中斷。ATM：是與DNA損傷檢驗有關(guān)的一個重要基因。最早發(fā)現(xiàn)于毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥患者，人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子，表現(xiàn)出對電離輻射敏感和易患癌癥。ATM編碼一個蛋白激酶，結(jié)合在損傷的DNA上，能將某些蛋白磷酸化，中斷細胞周期。其信號通路有兩條：激活Chk1（checkpoint kinase），使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中斷細胞周期。激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作為轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致P21的表達，P21抑制G1-S期CDK的活性，中斷細胞周

14、期。六、生長因子對細胞增殖的影響單細胞生物的增殖取決于營養(yǎng)，多細胞生物細胞的增值取決于機體是否需要。這種需要是通過細胞通信來實現(xiàn)的。生長因子：是與細胞增殖有關(guān)的信號物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進細胞增殖，又稱有絲分裂原（mitogen），如表皮生長因子（EGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）。生長因子不是由特定腺體產(chǎn)生，主要通過旁分泌作用于鄰近細胞。各種生長因子分子量大小不同。信號通路：ras途徑，cAMP途徑、磷脂酰肌醇途徑。如通過ras途徑，激活MAPK，MAPK進入細胞核內(nèi)，激活c-myc，myc作為轉(zhuǎn)錄因子促進cyclin D、SCF、E2F等G1-S 有關(guān)的基因表達，細胞進入G1期。 第二節(jié)

15、 癌細胞腫瘤（tumor）：是一種基因病，但并非是遺傳的；它是指細胞在致瘤因素作用下，基因發(fā)生了改變，失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致異常增生。動物體內(nèi)細胞分裂調(diào)節(jié)失控而無限增殖的細胞稱為腫瘤細胞(tumor cell)。具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤稱為惡性腫瘤（malignancy）。上皮組織的惡性腫瘤稱癌（cancer）。 良性腫瘤：生長緩慢，與周圍組織邊界明顯。不發(fā)生轉(zhuǎn)移，對人體健康危害不大。 惡性腫瘤（癌癥）：生長迅速，可轉(zhuǎn)移到身體其它部位，還會產(chǎn)生有害物質(zhì)，破壞正常器官結(jié)構(gòu)，使機體功能失調(diào)，威脅生命。據(jù)2001年衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展情況統(tǒng)計公報，惡性腫瘤為城市居民死因第一位。腫瘤組織由實質(zhì)和間質(zhì)兩部分構(gòu)成

16、，腫瘤實質(zhì)是腫瘤細胞，是腫瘤的主要成分，具有組織來源特異性。腫瘤的間質(zhì)起支持和營養(yǎng)腫瘤實質(zhì)的作用，不具特異性，一般由結(jié)締組織和血管組成，有時還可有淋巴管。一 癌細胞的主要特征（一）癌細胞的形態(tài)特征核質(zhì)比顯著高于正常細胞，可達1:1；核形態(tài)不一，并可出現(xiàn)巨核、雙核或多核現(xiàn)象。核內(nèi)染色體呈非整倍態(tài)，某些染色體缺失，而有些染色體數(shù)目增加。正常細胞染色體的不正常變化，會啟動細胞凋亡過程，但是癌細胞中，細胞凋亡相關(guān)的信號通路產(chǎn)生障礙，也就是說癌細胞具有不死性。線粒體表現(xiàn)為不同的多型性、腫脹、增生；細胞骨架紊亂；細胞骨架紊亂，某些成分減少，骨架組裝不正常。細胞表面特征改變，產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗體。（二）基本生物

17、學(xué)特征1、細胞生長與分裂失去控制，具有無限增殖能力，成為“永生”細胞。2、具有擴散性-癌細胞的細胞間粘著性下降，具有侵潤性和擴散性，這是癌細胞的基本特征。 -在分化程度上癌細胞低于良性腫瘤細胞，且失去了許多原組織細胞的結(jié)構(gòu)和功能。3、細胞間相互作用改變（識別改變；表達水解酶類；產(chǎn)生新的表面抗原）。4、蛋白表達譜系或蛋白活性改變（胚胎細胞蛋白、端粒酶活性升高）。5、mRNA轉(zhuǎn)錄譜系的改變（少數(shù)基因表達不同；突變位點不同，表型多變）。 6、染色體非整倍性。7、接觸抑制喪失，正常細胞在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)為貼壁生長和匯合成單層后停止生長的特點，即接觸抑制現(xiàn)象，而腫瘤細胞即使堆積成群，仍然可以生長。8、定著

18、依賴性喪失，正常真核細胞，除成熟血細胞外，大多須粘附于特定的細胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為定著依賴性。腫瘤細胞失去定著依賴性，可以在瓊脂、甲基纖維素等支撐物上生長。9、去分化現(xiàn)象，已知腫瘤細胞中表達的胎兒同功酶達20余種。胎兒甲種球蛋白（甲胎蛋白）是胎兒所特有的。但在肝癌細胞中表達，因此可做肝癌早期檢定的標(biāo)志特征。10、對生長因子需要量降低，體外培養(yǎng)的癌細胞對生長因子的需要量顯著低于正常細胞，是因為自分泌或其細胞增殖的信號途徑不依賴于生長因素。某些固體瘤細胞還能釋放血管生成因子，促進血管向腫瘤生長。獲取大量繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)。11、代謝旺盛，腫瘤組織的DNA和RNA聚合酶活性均高于正常組

19、織，核酸分解過程明顯降低，DNA和RNA的含量均明顯增高。12、蛋白質(zhì)合成及分解代謝都增強，但合成代謝超過分解代謝，甚至可奪取正常組織的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，結(jié)果可使機體處于嚴(yán)重消耗的惡病質(zhì)（cachexia）狀態(tài)。13、線粒體功能障礙，即使在氧供應(yīng)充分的條件下也主要是糖酵解途徑獲取能量。與三個糖酵解關(guān)鍵酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶）活性增加和同工酶譜的改變，以及糖原異生關(guān)鍵酶活性降低有關(guān)。14、可移植性，正常細胞移植到宿主體內(nèi)后，由于免疫反應(yīng)而被排斥，多不易存活。但是腫瘤細胞具有可移植性，如人的腫瘤細胞可移植到鼠類體內(nèi)，形成移植瘤。體外培養(yǎng)的惡性轉(zhuǎn)化細胞的特征惡性轉(zhuǎn)化細胞同癌細胞一樣具有

20、無限增殖的潛能；在體外培養(yǎng)時貼壁性下降；失去接觸抑制；培養(yǎng)時對血清依賴性降低；當(dāng)將惡性轉(zhuǎn)化細胞注入易感動物體內(nèi)，往往會形成腫瘤。二、原癌基因（oncogene）與抑癌基因（tumor-suppressor gene）惡性腫瘤的形成往往涉及多個基因的改變，與原癌基因、抑癌基因突變的逐漸積累有關(guān)。（一）原癌基因是細胞內(nèi)與細胞增殖相關(guān)的基因，在進化上高等保守。當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細胞過度增殖，從而形成腫瘤。原癌基因的產(chǎn)物主要包括：生長因子，如sis；生長因子受體，如fms、erbB；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分，如src、ras、raf；細胞周期蛋白，如cyclin D；細

21、胞凋亡調(diào)控因子，如bcl-2；轉(zhuǎn)錄因子，如myc、fos、jun。 （二）抑癌基因：抑制細胞增殖、促進細胞分化和抑制細胞遷移。抑癌基因的突變是隱性的。抑癌基因的產(chǎn)物主要包括：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子：如Rb、p53；負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子：如WT；周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI），如p21； ras GTP酶活化蛋白：如NF-1； DNA修復(fù)因子：如BRCA1、BRCA2；磷酸脂酶：如PTEN；細胞粘附分子：如DCC。癌癥產(chǎn)生是基因突變積累和自然選擇的結(jié)果癌癥主要是體細胞突變產(chǎn)生的遺傳病，涉及到兩大類與細胞增殖相關(guān)的基因的突變，細胞癌變是基因突變累積和自然選擇的結(jié)果，所以患者多為年長者。1、原癌基因與腫瘤抑制

22、基因產(chǎn)物協(xié)調(diào)作用，避免細胞癌變。2、促進細胞增殖相關(guān)基因突變：原癌基因突變形成癌基因。惡性腫瘤的發(fā)生是因為原癌基因的激活和抑癌基因的功能喪失，常涉及多個基因的改變。原癌基因的激活方式多種多樣，但概括來說是基因本身或其調(diào)控區(qū)發(fā)生了變異，導(dǎo)致基因的過表達，或產(chǎn)物蛋白活性增強，使細胞過度增殖，形成腫瘤。（1）點突變：ras基因家族，如膀胱癌中的ras基因僅有一個核苷酸的變異。（2）基因擴增：存在于某些造血系統(tǒng)惡性腫瘤中，如前髓細胞性白血病中，c-myc擴增832倍。（3）DNA重排：染色體的易位，使原癌基因處于活躍轉(zhuǎn)錄基因強啟動子的下游，將產(chǎn)生過度表達。（4）插入激活：某些不含v-onc的弱轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有冗長末端重復(fù)序列(LTR)，含有啟動子、增強子，插入基因組后引起下游基因過表達。3、抑制細胞增殖相關(guān)基因突變：腫瘤抑制基因。抑癌基因是正常細胞增殖過程中的負調(diào)控因子。抑癌基因編碼的蛋白抑制細胞增殖，使細胞停留于檢驗點上阻止周期進程。 抑癌基因發(fā)生功能喪失性突變(隱性突變)，則導(dǎo)致細胞周期失控而過度增殖。Rb基因突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細胞瘤形成。pRb對細胞周期運轉(zhuǎn)作用P53基因突變將導(dǎo)致細胞癌變或凋亡腫瘤形成的外因根據(jù)其性質(zhì)分為：化學(xué)、生物和物理致癌物三大類。根據(jù)它們在致癌過程中的作用，可分為-啟動