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1、概述蛋白質(zhì)的基本單位氨基酸肽蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測(cè)定第四章 蛋白質(zhì)化學(xué)第四章 蛋白質(zhì)化學(xué)學(xué)習(xí)目的:認(rèn)識(shí)生物大分子蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性。本章要求:掌握氨基酸的特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)和三字符號(hào);掌握肽鍵和多肽的概念以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn);掌握蛋白質(zhì)的性質(zhì)、分離純化的方法;掌握蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)概念和二級(jí)結(jié)構(gòu)的概念以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的類(lèi)型。第一節(jié) 概述一、蛋白質(zhì)的概念 由許多不同的-氨基酸按一定的序列通過(guò)酰胺鍵(肽鍵)縮合而成的,具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的大分子。1. 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)凡是有生命的地方,基本上都有蛋白質(zhì)起作用。蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)含量最高的組分,占許多生物體干重的45
2、50%以上。2. 蛋白質(zhì)是含氮元素恒定的生命物質(zhì)。各種蛋白質(zhì)中N元素的含量平均為16%。組成蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的元素有:C、H、O、N和S,這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為: C:5055% H:68% O:2023% N:1518 % S:04% 其它(P、Cu2+、Mn2+ 、Fe3+等) 微量 蛋白質(zhì)N平均含量為16%的特點(diǎn)作為凱氏(Kjedahl)定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的計(jì)算依據(jù)。 蛋白質(zhì)含量 = N含量6.25 二、蛋白質(zhì)的分類(lèi)1. 分類(lèi)依據(jù)蛋白質(zhì)不能按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)常用依據(jù):生物來(lái)源、理化性質(zhì)、分子形狀、化學(xué)組成等。2. 三種分類(lèi)方法按組成分類(lèi)常用1)根據(jù)分子形狀:球狀和纖維狀蛋
3、白;球狀蛋白:軸比小于10,較易溶解。常見(jiàn):血紅蛋白,血清球蛋白,豆類(lèi)球蛋白等。纖維狀蛋白:軸比大于10,不溶于水。常見(jiàn):羽毛中的角蛋白和蠶絲中的絲蛋白等。三、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能催化功能:酶;調(diào)節(jié)功能:激素、受體、毒蛋白等;結(jié)構(gòu)功能:構(gòu)成細(xì)胞和組織;運(yùn)輸功能:血紅蛋白,載脂蛋白等;免疫功能:抗體;運(yùn)動(dòng)功能:肌肉,纖毛和鞭毛;儲(chǔ)藏功能:乳汁中的酪蛋白等;生物膜的功能:通透性、信號(hào)傳遞、生理識(shí)別等。第二節(jié) 蛋白質(zhì)的基本單位氨基酸一、蛋白質(zhì)的水解1. 酸水解常以510倍的20%HCl煮沸回流1624h,或加壓于120水解12h。優(yōu)點(diǎn):水解徹底,產(chǎn)物為L(zhǎng)-氨基酸;缺點(diǎn):色氨酸破壞,水解液呈黑色。應(yīng)用:
4、氨基酸工業(yè)生產(chǎn)、蛋白質(zhì)分析等。第二節(jié) 蛋白質(zhì)的基本單位氨基酸2. 堿水解6mol/L NaOH或4 mol/L Ba(OH)2煮沸6h。優(yōu)點(diǎn):色氨酸未破壞,水解液清亮;缺點(diǎn):氨基酸發(fā)生旋光異構(gòu)。一般很少使用。3. 酶水解條件溫和,常溫(3660)、常壓和pH28,氨基酸未破壞,不發(fā)生旋光異構(gòu);但水解不徹底。 20種基本氨基酸三、氨基酸的分類(lèi)(1)根據(jù)酸堿性質(zhì):酸性氨基酸:谷氨酸和天冬氨酸;堿性氨基酸:精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸;中性氨基酸:15種,包括兩種酰胺。三、氨基酸的分類(lèi)(2)根據(jù)R的化學(xué)結(jié)構(gòu)脂肪族氨基酸:15種。芳香族氨基酸:Phe、Tyr 、Trp雜環(huán)氨基酸:His雜環(huán)亞氨基酸:Pro芳
5、香族側(cè)鏈氨基酸苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸帶正電的氨基酸賴(lài)氨酸 精氨酸 組氨酸帶負(fù)電的氨基酸天冬氨酸 谷氨酸四、氨基酸的性質(zhì)1. 一般物理性質(zhì) 無(wú)色晶體,熔點(diǎn)較高(200以上),能溶于水、稀酸或稀堿中,不溶于有機(jī)溶劑;除Gly外都有旋光性。2. 兩性解離和等電點(diǎn) 氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時(shí)都以離子形式存在,在同一個(gè)氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的NH3+正離子和能接受質(zhì)子的COO-負(fù)離子,為兩性電解質(zhì)。H3NCHCOOHR+在酸性溶液中的氨基酸(pHpI)H3NCHCOO-R+在晶體狀態(tài)或水溶液中的氨基酸(pH=pI)H2NCHCOO-R在堿性溶液中的氨基酸(pHpI)調(diào)節(jié)氨基酸溶液的pH,使氨基
6、酸分子上的+NH3基和COO-基的解離程度完全相等時(shí),即所帶凈電荷為零,此時(shí)氨基酸所處溶液的pH值稱(chēng)為該氨基酸的等電點(diǎn)(pI)。生理pH值時(shí),大多數(shù)氨基酸以?xún)尚噪x子存在。甘氨酸的酸堿滴定曲線(xiàn)氨基酸等電點(diǎn)的確定甘氨酸的解離等電點(diǎn)時(shí),Glu主要以兼性離子(R0)存在,R+和R-很小而且相等,R2-的量可忽略不計(jì)。因此 pI=1/2(pK1+pKR)帶有可解離R基的氨基酸有3個(gè)pK 。谷氨酸pI=3.22等電點(diǎn)時(shí),Lys主要以兼性離子(R0)存在,R2+的影響極小。因此 pI=1/2(pK2+pKR)2練習(xí)題1. 精氨酸的pK1(COO-)值為2.17,pK2 (NH3+ )值為9.04,pK3 (
7、胍基)值為12.48,其pI(等電點(diǎn)時(shí)的pH值)為_(kāi)。2. 用凱氏定氮法測(cè)定正常人血清含氮量為11.58 mg/ml, 則此人血清蛋白含量為 g/100ml。3. 人體八種必需氨基酸分別是 。練習(xí)題4. 寫(xiě)出下列氨基酸的三字母縮寫(xiě)符號(hào):天冬氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸。5.下列哪種氨基酸溶液不使平面偏振光發(fā)生偏轉(zhuǎn) A. Pro B. Gly C. Leu D. Lys6.含有兩個(gè)氨基的氨基酸是 A.谷氨酸 B.絲氨酸 C.酪氨酸 D.賴(lài)氨酸 E.蘇氨酸帶芳香環(huán)側(cè)鏈的氨基酸具有紫外吸收的能力,最大光吸收在280nm。利用氨基酸的紫外吸收測(cè)定蛋白含量。2. 紫外吸收芳香族氨基酸
8、 酪氨酸max278nm苯丙氨酸max259nm色氨酸max279nm(1)-氨基參與的反應(yīng)與亞硝酸反應(yīng):得到-羥基酸并放出氮?dú)狻J欠端箒?lái)克法定量測(cè)定氨基酸的基本反應(yīng)??梢杂冒被c總蛋白氮的比例表示蛋白質(zhì)的水解程度。3. 化學(xué)性質(zhì)3. 化學(xué)性質(zhì)(1)-氨基參與的反應(yīng)與甲醛發(fā)生羥甲基化反應(yīng):RCHCOO-NH3+RCHCOO-NH2+ H+OH-中和滴定HCHORCHCOO-NHCH2OHHCHORCHCOO-N(CH2OH)2與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)Sanger首先用此反應(yīng)鑒定多肽鏈或蛋白質(zhì)的NH2末端氨基酸。pH893. 化學(xué)性質(zhì)形成席夫堿反應(yīng):與醛類(lèi)化合物反應(yīng)。非酶促褐變的
9、一種機(jī)制。脫氨基和轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)在氨基酸氧化酶作用下,脫氨基生成-酮酸。轉(zhuǎn)氨酶催化下實(shí)現(xiàn)氨基轉(zhuǎn)移。如谷丙轉(zhuǎn)氨酶。(2)-羧基參與的反應(yīng)成鹽反應(yīng):與堿作用生成鹽,如谷氨酸一鈉。與重金屬離子形成的鹽不溶于水。(2)-羧基參與的反應(yīng)脫羧反應(yīng):在氨基酸脫羧酶作用下,生成一級(jí)胺。谷氨酸脫羧形成-氨基丁酸。-氨基丁酸(3)氨基和羧基共同參與的反應(yīng)與茚三酮的反應(yīng):藍(lán)紫色物質(zhì)(570nm)Pro產(chǎn)生黃色物質(zhì)(440nm) 。水合茚三酮 還原茚三酮2成肽反應(yīng)縮合生成酰胺鍵,通常稱(chēng)為肽鍵。(4)側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)巰基及二硫鍵:可與芐氯、碘乙酰胺等結(jié)合,保護(hù)巰基。兩個(gè)巰基氧化形成二硫鍵-S-S-,相互可形成氧化還原體系
10、,并且可以維持多肽分子和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。 羥基:可與酸成酯,如絲氨酸或蘇氨酸與乙酸、磷酸反應(yīng)成酯。巰基(-SH)的性質(zhì)作用:氧化還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵形成或斷裂。胱氨酸半胱氨酸第三節(jié) 肽一、肽的概念1.結(jié)構(gòu)由氨基酸構(gòu)成肽鍵:由一個(gè)氨基酸的-氨基與另一個(gè)氨基酸的-羧基縮合失水而形成的酰胺鍵。氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水形成肽。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式。肽鍵相連構(gòu)成了蛋白質(zhì)的主鏈。 肽鍵特點(diǎn):氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì),不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下,以反式結(jié)構(gòu)存在。肽(peptide )
11、氨基酸之間通過(guò)肽鍵聯(lián)結(jié)起來(lái)的化合物稱(chēng)為肽。兩個(gè)氨基酸形成的肽叫二肽,三個(gè)氨基酸形成的肽叫三肽,十個(gè)氨基酸形成的肽叫十肽,一般將十肽以下稱(chēng)為寡肽(oligopeptide),以上者稱(chēng)多肽(polypeptide)或稱(chēng)多肽鏈。氨基酸殘基(amino acid residues ) 肽鏈中的氨基酸在參加肽鍵形成時(shí)失去了1分子水,已經(jīng)不是原來(lái)完整的分子,稱(chēng)為氨基酸殘基。一條肽鏈通常含有一個(gè)游離的-氨基端(N-末端)和一個(gè)游離的-羧基端(C-末端)。規(guī)定肽鏈的氨基酸排列順序從其N(xiāo)-末端開(kāi)始,到C-末端終止。常把N-末端氨基酸殘基放在左邊,C-末端氨基酸殘基放在右邊。小分子肽一般按其氨基酸殘基排列順序命名
12、,如:Tyr-Gly-Gly-Phe-Met稱(chēng)為:酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甲硫氨酸(腦啡肽)。命名及書(shū)寫(xiě)方式二、 生物活性肽1. 谷胱甘肽參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)還原型谷胱甘肽(GSH)氧化型谷胱甘肽(GSSG)2.神經(jīng)肽神經(jīng)肽與神經(jīng)體液調(diào)節(jié)主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),包括腦啡肽、內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽等和P-物質(zhì)。具有嗎啡一樣的鎮(zhèn)痛作用。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽、-內(nèi)啡肽分別為16肽、31肽、17肽,它們的前五個(gè)氨基酸序列與蛋氨酸-腦啡肽的五肽相同。3.抗菌肽細(xì)菌的一種防御武器抑
13、制細(xì)菌和其他微生物生長(zhǎng)或繁殖的物質(zhì);由特定微生物產(chǎn)生,最常見(jiàn)的是青霉素,它是由半胱氨酸和纈氨酸結(jié)合成的二肽衍生物。主要破壞細(xì)菌細(xì)胞壁糖肽的合成,引起溶菌。第四節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。一、蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)1.一級(jí)結(jié)構(gòu)概念特指氨基酸的順序1969年,理論和應(yīng)用化學(xué)國(guó)際協(xié)會(huì)特規(guī)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)特指肽鏈中的氨基酸順序。維持一級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵:共價(jià)鍵,主要為肽鍵。書(shū)寫(xiě)方式:從N-末端到C-末端,用氨基酸的3字母縮寫(xiě)或單字母符號(hào)連續(xù)排列。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。1953年英國(guó)Sanger等人,完成了牛胰島素(Insulin)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定工作,分子量為5700
14、D,有A鏈(21Aa)和B鏈(30Aa)兩條肽鏈,兩個(gè)鏈間二硫鍵和一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(A鏈)。2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定氨基酸序列的自動(dòng)程序測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)確定的原則:將大化小,逐段分析,制成兩套肽片段,找出重疊位點(diǎn),排出肽的前后位置,最后確定蛋白質(zhì)的完整序列。片段重疊法,主要步驟為:測(cè)定氨基酸末端的數(shù)目,確定蛋白質(zhì)分子由幾條肽鏈構(gòu)成,并測(cè)得末端組成;對(duì)幾條肽鏈進(jìn)行拆分、分離;2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定肽鏈水解后進(jìn)行氨基酸組成分析;一種不完全水解,得到片段,分離后測(cè)定氨基酸順序;另一種不完全水解,測(cè)定片段氨基酸順序;比較兩套片段氨基酸順序,得到整個(gè)氨基酸順序;確定多肽鏈中二硫鍵的位置。一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法(1)肽鏈末端
15、分析末端氨基酸的測(cè)定:多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi),N-端氨基酸和C-端氨基酸。 N-末端測(cè)定A. 二硝基氟苯(DNFB)法反應(yīng)后酸水解,得到一個(gè)DNP-氨基酸和其余所有游離氨基酸的混合液。DNP-氨基酸為黃色,可用乙醚抽提,分離鑒定得到末端氨基酸。黃色二硝基氟苯(DNFB)法B. Edman法:生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物,通過(guò)層析法分離鑒定,Edman首先用此反應(yīng)鑒定多肽的N-端AA。PTH-氨基酸C. 丹磺酰氯法:在堿性條件下,得到丹磺酰-氨基酸。優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì),檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到110-9mol。D. 氨肽酶法: 一種肽鏈外切酶,它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向內(nèi)水解。 根據(jù)不
16、同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量,按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn),從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。C-末端測(cè)定A. 肼解法:多肽與肼在無(wú)水條件下加熱,C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái),其余的氨基酸則變成肼化物。 肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。 B. 羧肽酶法: 一種肽鏈外切酶,它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。 根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量,從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。 常用的羧肽酶至少包括A、B、C三種; 羧肽酶A能水解除Pro、Ar
17、g和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基; B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵; C能水解C-末端的任何一個(gè)殘基。(2)二硫鍵的拆開(kāi)和肽鏈的分離肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵連接,可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理,將肽鏈分開(kāi);二硫鍵的打開(kāi):氧化還原法,即用過(guò)量的-巰基乙醇或二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇處理,然后用碘乙酸(ICH2COOH)保護(hù)巰基。也可以用過(guò)甲酸(HCOOOH)處理。二硫鍵的拆分二硫蘇糖醇過(guò)甲酸碘乙酸(3)肽鏈的部分水解和肽段的分離蛋白質(zhì)裂解成小肽,然后分離并測(cè)定肽段的氨基酸序列。選用專(zhuān)一性強(qiáng)的蛋白水解酶或化學(xué)試劑進(jìn)行有控制的裂解。基本要求:選擇性強(qiáng),裂解點(diǎn)少,反應(yīng)產(chǎn)率高?;痉椒?/p>
18、:化學(xué)裂解(溴化氰裂解和酸水解)、酶解法(胰蛋白酶等)。溴化氰水解法:專(zhuān)一性地切斷肽鏈中由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。專(zhuān)一性強(qiáng),切點(diǎn)少且產(chǎn)率高,片段較大。(3)肽鏈的部分水解和肽段的分離部分酸水解:測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成,稀酸條件下,肽鏈Asp的羧基端易斷裂,濃酸條件下,含羥基氨基酸的氨基端肽鍵易斷裂。酶解法: 胰蛋白酶:作用Arg和Lys羧基端肽鍵; 胰凝乳蛋白酶:芳香族氨基酸及一些有大的非極性側(cè)鏈的氨基酸的羧基端肽鍵。(4)肽段的氨基酸序列測(cè)定采用Edman降解法、酶解法等。酶解法:利用一種酶水解產(chǎn)生一個(gè)或兩個(gè)可知末端特征的片段,再用另一種酶作用產(chǎn)生另一組片段,然后后一組片段進(jìn)行色譜分離并
19、進(jìn)行末端測(cè)定,最后進(jìn)行片段重疊分析,確定氨基酸序列。(5)肽段在多肽鏈中次序的推斷采用肽段重疊法。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊,拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。氨基酸組分分析Sanger 反應(yīng)測(cè)定N-端氨基酸Edman 反應(yīng)測(cè)定氨基酸序列末端分析氨基酸組分分析末端氨基酸測(cè)定還原二硫鍵用兩種以上方法將蛋白裂解成短肽測(cè)定短肽序列短肽序列拼裝胰蛋白酶溴化氰片段重疊法練習(xí)題有一多肽經(jīng)酸水解后產(chǎn)生等摩爾的Lys,Gly和A1a,如用胰蛋白酶水解該肽,僅發(fā)現(xiàn)有游離的Gly和一種二肽。下列多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)中,哪一個(gè)符合該肽的結(jié)構(gòu)?A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-AlaB.Ala-
20、Lys-GlyC.Lys-Gly-AlaD.Gly-Lys-AlaE.Ala-Gly-Lys練習(xí)題一個(gè)七肽,經(jīng)分析氨基酸組成是:Lys, Pro, Arg, Phe, Ala,Tyr和Ser,此多肽與DNFB不反應(yīng)。經(jīng)胰凝乳蛋白酶處理后,斷裂成兩個(gè)肽段,其氨基酸組成分別為Ala,Tyr,Ser和Pro,Phe,Lys,Arg。這兩個(gè)肽段與DNFB反應(yīng),可分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應(yīng),同樣能生成兩個(gè)肽段,它們的氨基酸組成分別是Arg,Pro和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala。試問(wèn)此七肽的結(jié)構(gòu)是怎樣的?二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)1. 概念蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)系非共價(jià)結(jié)構(gòu)(
21、1)含義:二級(jí)結(jié)構(gòu):指肽鏈借助氫鍵排列成沿一個(gè)方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象,不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象。三級(jí)結(jié)構(gòu):指多肽鏈借助各種次級(jí)鍵盤(pán)繞成特定的不規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu):指寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間排布上的相互關(guān)系或結(jié)合方式。在蛋白鏈中,羰基和氨基具有形成氫鍵的潛能,蛋白質(zhì)鏈內(nèi)和鏈間氫鍵促使蛋白質(zhì)形成一些規(guī)則的折疊單元,即所謂的二級(jí)結(jié)構(gòu)。(2)維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵氫鍵:主要維持-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)。靜電引力:也稱(chēng)離子鍵或鹽鍵,對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性貢獻(xiàn)不大。范德華力:對(duì)維持蛋白質(zhì)活性中心構(gòu)象非常重要。疏水相互作用:維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu);二硫鍵:兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)
22、鍵主要是次級(jí)鍵。次級(jí)鍵:除共價(jià)鍵、離子鍵和金屬鍵外基團(tuán)間和分子間相互作用力的總稱(chēng)。肽平面兩個(gè)旋轉(zhuǎn)角:(C-N)、( C-C)氨基酸殘基側(cè)鏈結(jié)構(gòu)、極性造成空間位阻,使旋轉(zhuǎn)角度不能超過(guò)0180范圍;C=O和N-H間的氫鍵也限制了二者的旋轉(zhuǎn)。(3)蛋白質(zhì)分子中肽鏈的空間結(jié)構(gòu)原則2.二級(jí)結(jié)構(gòu)肽鏈的螺旋折疊(1)-螺旋(- helix) 1951年P(guān)auling和Corey根據(jù)-角蛋白(-keratin)的X射線(xiàn)衍射結(jié)果提出的。 -螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn):a.主鏈圍繞中心軸螺旋上升,每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈,相當(dāng)于0.54nm,每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升0.15nm,每個(gè)氨基酸旋轉(zhuǎn)100 。b.相鄰螺圈之間形
23、成鏈內(nèi)氫鍵;c. R側(cè)鏈在螺旋的外側(cè);d.天然蛋白質(zhì)絕大多數(shù)為右手螺旋。-螺旋-螺旋影響-螺旋形成和穩(wěn)定的因素a. 氨基酸的組成和排列順序多聚丙氨酸( -螺旋)多聚賴(lài)氨酸(無(wú)規(guī)則卷曲)遇到脯氨酸螺旋被中斷或拐彎。b. 氨基酸所帶電荷性質(zhì)c. R側(cè)鏈的大?。嚎臻g位阻。-折疊結(jié)構(gòu)要點(diǎn)a. 肽鏈幾乎是完全伸展的;b.肽鏈成鋸齒狀,按層平行排列,肽平面呈片狀;c. 相鄰肽鏈的C=O與N-H形成氫鍵,氫鍵幾乎垂直于肽鏈;d. 肽鏈的R側(cè)鏈基團(tuán)在肽平面的上下交替出現(xiàn);e. 折疊片以反平行式結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。 -折疊與-螺旋的轉(zhuǎn)變:頭發(fā)中的角蛋白。(2)-折疊(-pleated sheet )反平行平行(3)-轉(zhuǎn)
24、角(- turn)指肽鏈出現(xiàn)的180回折,由彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的-NH之間形成氫鍵。Gly和Pro出現(xiàn)頻率高。(4)無(wú)規(guī)則卷曲:沒(méi)有確定規(guī)律性的部分肽鏈構(gòu)象,肽鏈中肽鍵平面不規(guī)則排列,屬于松散的無(wú)規(guī)卷曲(random coil)。 兩種典型的轉(zhuǎn)角3. 三級(jí)結(jié)構(gòu)肽鏈非幾何形的進(jìn)一步折疊蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步卷曲折疊,構(gòu)成一個(gè)不規(guī)則的特定構(gòu)象。包括全部主鏈、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排布,但不包括肽鏈的相互作用。只有三級(jí)結(jié)構(gòu)才是蛋白質(zhì)生物活性的特征構(gòu)象。維系三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力:氫鍵、二硫鍵、離子鍵、疏水作用力和范德華力。肌紅蛋白由一條肽鏈
25、(153個(gè)氨基酸殘基)組成。它由8個(gè)-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。4. 四級(jí)結(jié)構(gòu)亞基間的相互關(guān)系蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu):由兩條或兩條以上的具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵鍵聚合而成的特定構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每個(gè)最小共價(jià)單位稱(chēng)為亞基。亞基一般由一條肽鏈組成。四級(jí)結(jié)構(gòu)涉及亞基的種類(lèi)和數(shù)目以及各亞基在整個(gè)分子中的空間排布,包括亞基間的接觸位點(diǎn)和相互作用關(guān)系。維持四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力:疏水作用力。血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(1)同功蛋白質(zhì)氨基酸的種屬差異和分子進(jìn)化同功蛋白質(zhì):不同種屬來(lái)源的執(zhí)行同種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì);結(jié)構(gòu)包括兩部分:不變的氨基酸序列,決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)
26、和功能;可變的氨基酸序列:體現(xiàn)種屬差異。同功蛋白質(zhì)組成上的差異體現(xiàn)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(2)同功蛋白質(zhì)中氨基酸序列的個(gè)體差異和分子病同種蛋白質(zhì):同種生物具有相同生物活性的蛋白質(zhì);個(gè)體差異:同種蛋白質(zhì)氨基酸序列的細(xì)微差異。引起分子病,個(gè)體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致生物學(xué)功能改變。(3)一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活血液凝固的生化機(jī)理;胰島素原的激活。鐮刀形細(xì)胞貧血病血紅蛋白亞基N端的第6號(hào)氨基酸殘基發(fā)生了變異,它變異來(lái)源于基因上遺傳信息的突變。血液凝固的生化機(jī)理第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)分子的大小1.相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)是巨大分子相對(duì)分子質(zhì)量一般為1萬(wàn)到
27、幾百萬(wàn)。2.測(cè)定方法蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定(1)根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量例如血紅蛋白含鐵量為0.335%,最低相對(duì)分子質(zhì)量=55.84/0.335%16700其他方法測(cè)定血紅蛋白分子量為68000。第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)(2)物理化學(xué)方法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量滲透壓測(cè)定法超離心法:包括沉降速度法(沉降系數(shù)S)和沉降平衡法(根據(jù)密度分離)。二、兩性解離多價(jià)解離蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)主要指?jìng)?cè)鏈的可解離基團(tuán),包括氨基、羧基、咪唑基、胍基、巰基、酚基等。蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量是由蛋白質(zhì)分子中的可解離基團(tuán)的種類(lèi)和數(shù)目以及溶液pH決定的。第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)等電點(diǎn)蛋白質(zhì)多種性質(zhì)達(dá)到最低值等電
28、點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不移動(dòng)。pH等電點(diǎn),蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷,向正極移動(dòng)pH等電點(diǎn),蛋白質(zhì)粒子帶正電荷,向負(fù)極移動(dòng)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí),因沒(méi)有同性電荷排斥,故最不穩(wěn)定,溶解度最小,易聚集成較大的顆粒,易沉淀析出(分離提純蛋白質(zhì)的方法)。電泳:帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向電荷相反的電極泳動(dòng)的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室、生產(chǎn)、臨床診斷等常用電泳分離蛋白質(zhì)和鑒定蛋白質(zhì)純度。 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)三、膠體性質(zhì)1. 膠體性質(zhì)親水膠體膠體形成條件:粒子大小在1100nm之間;帶相同電荷;與溶劑之間形成溶劑化層。蛋白質(zhì):220nm。2.滲析滲析或透析:蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜,可將其與一些小分子物質(zhì)分開(kāi)。超濾:利用外加壓力或離心力使水和其他
29、小分子通過(guò)半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上。四、沉淀作用1.蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定因素:水化層:蛋白質(zhì)分子表面的親水基團(tuán)(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等)+水;帶電層:表面可解離基團(tuán)在一定pH環(huán)境下解離產(chǎn)生,同性電荷相互排斥。蛋白質(zhì)的沉淀作用:條件改變時(shí),蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性被破壞,蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象。原因:破壞水化層和帶電層。四、沉淀作用2.沉淀方法:高濃度中性鹽、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑等都可引起蛋白質(zhì)沉淀。加入高濃度的中性鹽(如NH42SO4、NaCl等),可有效破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層,同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)的電荷,使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱(chēng)為鹽
30、析(salting out)。當(dāng)除去鹽后,可再溶解。鹽析法是最常用的分離蛋白質(zhì)的方法??膳c水混合的有機(jī)溶劑,如酒精、甲醇、丙酮等,對(duì)水的親和力很大,能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜,使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液至等電點(diǎn)時(shí),加入有機(jī)溶劑可加速蛋白質(zhì)沉淀。常溫下有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。在低溫條件下,則變性進(jìn)行較緩慢,可用于分離制備蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑沉淀法當(dāng)溶液pH值高于等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷,它易與重金屬離子(Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的,誤食重金屬鹽后可大量飲用牛奶或豆?jié){等蛋白質(zhì),然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬鹽嘔吐出來(lái)解
31、毒。若在低溫條件下,并控制重金屬離子濃度,也可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。重金屬鹽沉淀pH小于等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷,易與帶負(fù)電(酸根陰離子)的生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過(guò)氯酸、硝酸) 生成不溶性鹽而沉淀。血液化學(xué)分析時(shí)常利用此原理除去血液中的蛋白質(zhì),此類(lèi)沉淀反應(yīng)也可用于檢驗(yàn)?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。 生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)因受理化因素影響,使其維系空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵受到破壞,使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物活性改變或喪失,稱(chēng)為變性作用(denaturation)。引起蛋白質(zhì)發(fā)生變性的因素化學(xué)因素:強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、苦味酸、
32、乙醇等。物理因素:加熱(70100)、加壓、脫水、劇烈振蕩或攪拌、紫外線(xiàn)、X-射線(xiàn)照射、超聲波等。五、蛋白質(zhì)的變性作用維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵被破壞,一級(jí)結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵(肽鍵)沒(méi)有被破壞。分為可逆變性和不可逆變性。變性后的特點(diǎn): 喪失生物活性; 溶解度降低; 易被水解(對(duì)水解酶的抵抗力減弱)。應(yīng)用:變性因素常用于消毒及滅菌;保存蛋白質(zhì)制劑時(shí)應(yīng)注意防止蛋白質(zhì)變性。變性的本質(zhì)和應(yīng)用雙縮脲反應(yīng)茚三酮反應(yīng)米隆反應(yīng)坂口反應(yīng)Folin-酚反應(yīng)乙醛酸反應(yīng)黃色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)(Biuret Reaction)蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色(540nm),稱(chēng)雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩
33、個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物都呈此反應(yīng),所有蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。茚三酮反應(yīng)(Ninhydrin Reaction)-氨基酸和所有蛋白質(zhì)均可與水合茚三酮作用產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)。 雙縮脲反應(yīng)米隆反應(yīng)(Millon Reaction)蛋白質(zhì)溶液中加入米隆試劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液),蛋白質(zhì)首先沉淀,加熱則變?yōu)榧t色沉淀,此為酪氨酸的酚基所特有的反應(yīng),因此含有酪氨酸的蛋白質(zhì)均呈米隆反應(yīng)。 此外,蛋白質(zhì)溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發(fā)生顏色反應(yīng)。 第六節(jié) 蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測(cè)定一、分離純化的一般原則及基本步驟1.一般原則根據(jù)性質(zhì)設(shè)計(jì)分離純化方法所用原料來(lái)源方便,成本低;目的蛋白
34、質(zhì)含量、相對(duì)活性高;可溶性和穩(wěn)定性好;基因分子背景如何等要明確;破碎細(xì)胞條件要溫和;盡量去除雜質(zhì)、脂類(lèi)、核酸及毒素;大部分操作在溶液中進(jìn)行;建立靈敏、特異、精確的檢測(cè)方法。第六節(jié) 蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測(cè)定一、分離純化的一般原則及基本步驟2.基本步驟分離純化的戰(zhàn)略取材:含量豐富,便于提??;組織細(xì)胞破碎:機(jī)械法:組織分散器、勻漿器等;物理法:超聲波、滲透壓、壓榨等;化學(xué)法:酸、堿等;酶法:溶菌酶、纖維素酶等。分離純化基本步驟提?。哼x擇適當(dāng)溶劑;水溶性蛋白:應(yīng)用中性緩沖溶液抽提;酸性蛋白:稀堿性溶液抽提;脂溶性蛋白:有機(jī)溶劑抽提。分離純化*;結(jié)晶;鑒定、分析。第六節(jié) 蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與
35、測(cè)定二、分離純化的基本方法1. 鹽析與等電點(diǎn)沉淀根據(jù)溶解度分離(1)鹽析:高濃度中性鹽溶液,水化層被破壞和表面電荷被中和,發(fā)生沉淀,常用硫酸銨。(2)等電點(diǎn)沉淀:凈電荷為零,分子間靜電排斥力最小,容易聚集沉淀,此時(shí)溶解度最小。沉淀的蛋白質(zhì)保持天然構(gòu)象,能再溶解。二、分離純化的基本方法2.離子交換色譜根據(jù)電荷性質(zhì)不同一定pH下蛋白質(zhì)所帶電荷不同進(jìn)行分離;利用離子交換劑,靠相反電荷間的靜電吸引,根據(jù)帶電荷多少進(jìn)行分離,結(jié)合力小的先被洗脫。常用離子交換劑:CM-纖維素(弱酸型):陽(yáng)離子交換劑;DEAE-纖維素(弱堿性):陰離子交換劑。離子交換層析二、分離純化的基本方法3.凝膠過(guò)濾根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量不同
36、介質(zhì):交聯(lián)葡萄糖(葡聚糖)、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠顆粒。凝膠顆粒具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些網(wǎng)孔只允許較小的分子進(jìn)入顆粒內(nèi),而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。當(dāng)用洗脫液洗脫時(shí),被排阻的相對(duì)分子質(zhì)量大的分子先被洗脫下來(lái),相對(duì)分子質(zhì)量小的分子后下來(lái)。大分子快,小分子慢例題1指出下列蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱時(shí)的洗脫順序,蛋白質(zhì)分布范圍從5000到600000。肌紅蛋白:16900;過(guò)氧化氫酶:247500;細(xì)胞色素C:13370;肌球蛋白:524800;胰凝乳蛋白酶原:23240;血清清蛋白:68500。二、分離純化的基本方法4. 親和色譜根據(jù)特異性親和力不同分離根據(jù)不同蛋白質(zhì)對(duì)特定配體的特異性而非共價(jià)結(jié)
37、合的能力不同進(jìn)行分離的?;静襟E:選擇配體;配體與載體(瓊脂糖類(lèi))共價(jià)連接;裝柱后蛋白質(zhì)被特異性吸附,其它物質(zhì)流出;洗脫。親和層析三、氨基酸的分離1.濾紙色譜根據(jù)溶解度不同進(jìn)行的分配色譜當(dāng)一種溶質(zhì)在兩種一定的不互溶或幾乎不互溶的溶劑中分配時(shí),在一定溫度下達(dá)到平衡后,在兩相中的濃度比值與在這兩種溶劑中的溶解度比值相等,稱(chēng)為分配定律。分配系數(shù)=溶質(zhì)在溶劑A中濃度/溶質(zhì)在溶劑B中濃度以濾紙為支持物,濾紙纖維吸附水為固定相,有機(jī)溶劑為移動(dòng)相,分離氨基酸。三、氨基酸的分離Rf=原點(diǎn)到色譜點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離Rf越大,說(shuō)明該物質(zhì)前進(jìn)越快,在有機(jī)相中的溶解度越大。三、氨基酸的分離2.離子交換色
38、譜根據(jù)電荷性質(zhì)不同一定pH下氨基酸所帶電荷不同進(jìn)行分離;利用離子交換劑(SO32-H+或-N(CH3)3+OH-),靠相反電荷間的靜電吸引,根據(jù)帶電荷多少進(jìn)行分離。洗脫液中氨基酸的濃度由茚三酮反應(yīng)的顏色深淺來(lái)檢測(cè)。例題2將含有天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和賴(lài)氨酸的檸檬酸緩沖液(pH=3),加到預(yù)先同樣緩沖液平衡過(guò)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中,隨后用此緩沖液洗脫此柱,并分別收集洗出液,這5種氨基酸將按什么次序洗脫下來(lái)?3. 薄層色譜根據(jù)吸附性質(zhì)不同將固體吸附劑(纖維素粉末、硅膠粉等)涂布在玻璃板等支持物上,根據(jù)吸附劑對(duì)樣品中各組分的吸附力不同來(lái)進(jìn)行。4. 紙電泳與薄膜電泳電場(chǎng)下分離外電場(chǎng)作用下,帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。u=QE/6r三、氨基酸的分離例題3下列氨基酸的混合物在pH3.9時(shí)進(jìn)行紙電泳,指出哪一些氨基酸朝正極移動(dòng),哪一些朝負(fù)極移動(dòng)。 Ala
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