醫(yī)學(xué)第一章-血液標(biāo)本采集和血涂片制備課件

1、臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)血液一般檢驗(yàn)主講人：宮愛華（大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院檢驗(yàn)科）聯(lián)系電話一章 血液標(biāo)本采集和血涂片制備重點(diǎn)：血標(biāo)本采集方法和血涂片制備技術(shù)難點(diǎn)：各種抗凝劑的優(yōu)缺點(diǎn)和使用選擇 第一節(jié) 血液標(biāo)本采集和抗凝劑選擇血標(biāo)本：全血：血細(xì)胞+血漿;臨床血液學(xué)檢查，血細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類和形態(tài) 學(xué)檢查血漿：全血除去血細(xì)胞；血漿病理性和生理性化學(xué)成分的測(cè)定，內(nèi)分泌激素、凝血因子（鈣除外）、血栓和止血檢查血清：離體后血液自然凝固后析出的液體成分（除纖維蛋白原等凝血因子）；臨床化學(xué)和臨床免疫學(xué)檢查 一、采血方法 靜脈采血法部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背、內(nèi)踝、股靜脈，幼兒可采用頸外靜脈采

2、血采血器材：一次性注射器采血步驟和注意事項(xiàng)：止血帶壓迫時(shí)間不能過長；注射器和容器必須干燥采血步驟 選擇適宜靜脈，在臂扎上壓脈帶，于穿刺處皮膚做環(huán)形消毒 讓病人握拳，使靜脈顯露。左手拇指固定穿刺部位下端，右手持注射器，使針筒刻度向上，先以約30o角度沿靜脈正面進(jìn)針，穿過皮膚刺人靜脈腔。 見回血后，右手固定注射器，用左手緩緩抽出注射器針?biāo)?，至所需血量后，解除壓脈帶，放松拳頭，以消毒棉簽壓住穿刺孔，拔出針頭 部位：中指或無名指尖內(nèi)側(cè)、耳垂；半歲以下拇指或足部，特殊人員視情況而定所用器材：采血針、吸管采血步驟及注意事項(xiàng)：避免交叉應(yīng)嚴(yán)格實(shí)行一人一針制；穿刺的深度的適當(dāng)，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響

3、檢驗(yàn)結(jié)果。 皮膚采血法（毛細(xì)血管采血法）方法學(xué)評(píng)價(jià) 靜脈采血 皮膚采血 真空采血缺點(diǎn) 不同抗凝劑的使用， 限制了重復(fù)實(shí)驗(yàn)； 價(jià)格高 改變血液性質(zhì)，影 易于溶血、凝血 響有形成分的形態(tài); 和可混入組織液 環(huán)境污染優(yōu)點(diǎn) 標(biāo)本代表性大，無 價(jià)廉、快速、操作 減少溶血，操 組織液影響，適于 簡便，標(biāo)本可直接 作規(guī)范，防止 臨床研究，可重復(fù) 測(cè)定 交叉感染，保 實(shí)驗(yàn)和追加其他實(shí) 護(hù)環(huán)境 驗(yàn) 質(zhì)量控制患者：活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、藥物、年齡、性別標(biāo)本采集等采血：操作規(guī)范溶血：采集、轉(zhuǎn)移、保管、分離血標(biāo)本處理：立即送檢實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：藥物、飲食的影響；密切結(jié)合臨床 肝素（heparin） 原理：低濃度時(shí)抑制因子a

4、、和PF3之間的作用，加強(qiáng)抗凝血酶（AT-）滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成,還能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子的作用；高濃度時(shí)阻斷凝血酶和纖維蛋白的反應(yīng)適用方法： 1g/L濃度的肝素鈉與血液 1：10優(yōu)點(diǎn)：抗凝能力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易溶血、能耐高溫適用范圍：紅細(xì)胞檢驗(yàn)（紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白測(cè)定、紅細(xì)胞比積）和多種生化分析 枸櫞酸鹽（枸櫞酸三鈉）原理：螯合鈣離子使用方法：配成109 mmol/L的濃度和血液1：9 106 mmol/L的濃度和血液1：4適用范圍：止血學(xué)檢驗(yàn)、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性?。?物理方法抗凝脫纖維蛋白：將血液注入有玻璃珠的器皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)，纖維蛋白纏繞凝固于玻璃球，

5、從而防止血成凝塊。適用于免疫學(xué)檢驗(yàn)和紅斑性狼瘡細(xì)胞檢查。 血液的貯存 1. 血液標(biāo)本檢驗(yàn)前的預(yù)處理 分離血清或血漿 預(yù)溫血漿或血清 分離細(xì)胞 一、血液涂片制備將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動(dòng)。圖1-3 血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀） 血涂片質(zhì)量評(píng)價(jià)均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè)注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚一張良好血涂片的標(biāo)準(zhǔn)是：厚薄適宜、頭體尾分明、細(xì)胞分布均勻、邊緣整齊、兩側(cè)及兩頭留有空隙。 二、血液細(xì)胞染色 染料：生物學(xué)染色劑，將生物組織細(xì)胞和病原體染色，在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)。 發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)使生物學(xué)染色劑產(chǎn)生顏色和被

6、染組織親合。堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，染細(xì)胞核 的染料。如亞甲藍(lán)、天青。酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。主要有熒 烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結(jié)合 細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、 嗜酸性顆粒成分等。復(fù)合染料：同時(shí)具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料 細(xì)胞染色原理： 一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué)現(xiàn)象為依據(jù)物理作用：毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學(xué)作用：a. 染料的化學(xué)成分：助色基團(tuán)的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。b. 蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同 數(shù)量的氨基

7、（-NH2）和羧基（-COOH），同時(shí)還有其 它活性基團(tuán)。在游離狀態(tài)時(shí)， -NH2獲得一個(gè)H+變成 帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個(gè)H+變成帶負(fù)電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。 c. 周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pHpI（ pI 為等電 點(diǎn)），則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之， pHpI，則結(jié)合堿性染料。 染色原理 細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對(duì)各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞

8、漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。 M+CL + Na+E ME + NaCL 美藍(lán) 伊紅 伊紅化美藍(lán)（瑞氏染料） 圖1-4 瑞氏染色原理示意圖 PH對(duì)細(xì)胞染色有影響 細(xì)胞各種成分均為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對(duì)氫離子濃度十分敏感，染色用玻片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細(xì)胞染色反應(yīng)異

9、常，以致識(shí)別困難，甚至造成錯(cuò)誤。 試劑 Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml甲醇：有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)， 并使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對(duì)染料的吸附作用，增強(qiáng)染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g, 蒸餾水加到1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。 染色方法1. 用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。2. 加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。3. 滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。4. 用清水沖洗，待干后鏡檢。 【質(zhì)量控制

10、】血膜要干透后才能染色，否則染色時(shí)易脫落.染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時(shí)間長些效果好。染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時(shí)間也不能長。染色過淡，可復(fù)染。染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色.【染色結(jié)果評(píng)價(jià)】 正常情況：血膜外觀呈淡琥珀色。在顯微鏡下紅細(xì)胞染成粉紅色，在厚薄均勻處略有碟狀感。白細(xì)胞胞質(zhì)中的顆粒能顯示出各種細(xì)胞的特有色彩，細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。 染色環(huán)境偏酸：則紅細(xì)胞和嗜酸性顆粒偏紅，白細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或不著色，染色過酸pH3.5時(shí)，則呈現(xiàn)一片紅色，白細(xì)胞中除嗜酸性顆粒外均不著色。 染色環(huán)境偏堿

11、：則所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，微偏堿者紅細(xì)胞暗紅、白細(xì)胞顆粒深暗。嗜酸性顆?？扇境砂岛稚踔梁谧仙蛩{(lán)色。中性顆粒也偏粗染成紫黑色，血膜過厚的地方呈綠色。姬姆薩染色法 原理 吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié) 果與瑞特染色法基本相同。但本法對(duì)細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復(fù)合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液，按瑞特染色法染10min?；蛳扔萌鹛厝旧ㄈ旧?，再用稀釋吉姆薩復(fù)染。吉姆薩染料 1.0g 甘油 66.0ml甲醇（AR） 66.0ml染色方法 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 將血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水沖洗,待干后鏡檢試劑 瑞氏-吉姆薩染色 【原理】 將瑞特染料和吉姆薩染料按一定比例混合后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，其染色原理同瑞特和吉姆薩染色法，但染色效果更佳，因?yàn)槠渚C合了瑞士和吉姆薩染色法的優(yōu)點(diǎn)。 【試劑】瑞特染料 1.0g吉姆薩染料 0.3g甲醇 加至500ml 先將瑞特染料和吉姆薩染料充分研磨混勻，甲醇溶解倒入容器中，未溶解完的繼續(xù)加入甲醇研磨，重復(fù)多次，最后把染液加至500ml。染色方法 血片加滴加染液5滴，并立即將染液蓋滿血膜，2min后加入pH6.4-6.8磷酸鹽緩沖液（同瑞氏染液）緩沖液10滴，10min后用流水沖洗干