核基因轉(zhuǎn)錄及加工課件

1、真核生物基因轉(zhuǎn)錄Roger D. Kornberg was awarded the 2006 Nobel Prize in Chemistry for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription. 真核生物基因轉(zhuǎn)錄特點： 1.轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同類型的RNA有不同的啟動序列； 2.多種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄不同的RNA產(chǎn)物； 3.多個調(diào)節(jié)因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)； 4.轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上分隔，轉(zhuǎn)錄后存在廣泛的加工。 1. RNA聚合酶啟動子、調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響RN

2、A聚合酶活性。RNA Pol I: rRNA, 相對活性50-70%RNA Pol II: mRNA,相對活性20-40% miR-RNA Pol III: tRNA,相對活性10%RNA Pol IV: small ncRNA,相對活性?真核生物三種RNA聚合酶的比較真核生物的啟動子及其他特異DNA序列Sequence elements within a typical eukaryotic gene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301 based on the thymidine kinase gene octamertranscription elementpro

3、moterTATA box (TATAAAA) located approximately 25-30 bp upstream of the +1 start site determines the exact start site (not in all promoters) binds the TATA binding protein (TBP) which is a subunit of TFIIDGC box (CCGCCC) binds Sp1 (Specificity factor 1)CAAT box (GGCCAATCT) binds CTF (CAAT box tf)Octa

4、mer (ATTTGCAT) binds OTF (Octamer transcription factor)+1ATTTGCATTSS核心元件區(qū)上游調(diào)控區(qū)基因調(diào)控區(qū)：由三部分組成 核心元件區(qū)：決定是否轉(zhuǎn)錄 由TATAbox和起始位點（TSS）組成上游調(diào)控區(qū)UPE (Upstream Promoter Element) ： 具多種調(diào)控元件 CAAT框、GC框等，含其中一種或多種，決定轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱（轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄起始頻率），啟動子的強(qiáng)弱取決于UPE的類型。確定真正的起始位點遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)： 位于轉(zhuǎn)錄起始位點更上游；如 珠蛋白基因的遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)在-1300 -3300間 增強(qiáng)子：使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯

5、增強(qiáng)的DNA序列，作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)元件。 特點： 1.增強(qiáng)效應(yīng)明顯（10 200倍）； 2.增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)； 3.大多為重復(fù)序列，一般50bp； 4.增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性，只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能；5. 沒有基因?qū)Ｒ恍浴?作用機(jī)制：通過改變模板DNA的整體結(jié)構(gòu)（影響DNA-Pro復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或改變DNA超螺旋密度） eg.形成Z-DNA，增強(qiáng)子才有功能。 一個增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激附近的任一啟動子。Gene cloneHACNS1增強(qiáng)子HACNS1（又叫CENTG2）是對進(jìn)化有貢獻(xiàn)的一個基因增強(qiáng)子。 如今有證據(jù)顯示在

6、人類基因組發(fā)現(xiàn)的十一萬基因增強(qiáng)子中HACNS1在人類與祖先黑猩猩分道揚鑣之后的進(jìn)化過程中變化最大，對人手指和可能改造腳踝以適應(yīng)人類兩腿行走意義 。 RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物polTFHTAFTFFTAFTAFTFATFBTBPTATA DNATAF: TBP associated factorsholoenzyme（1）基本轉(zhuǎn)錄因子 (general transcription factor) 是指能夠直接或間接與啟動子核心序列TATA盒特異結(jié)合、并啟動轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白。TBP: TATA-box binding proteinTFII: pol II associ

7、ated TF(2) 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 (transcription factor, TF) 這類調(diào)節(jié)蛋白能識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點的上游序列和遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子元件，通過DNA蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。決定不同基因的時間、空間特異性表達(dá).轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptional activator)轉(zhuǎn)錄阻遏因子(transcriptional repressor)（3）共調(diào)節(jié)因子 (transcriptional regulator/ co-factor) 首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白蛋白相互作用，進(jìn)而影響它們的分子構(gòu)象，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,本身無DNA結(jié)合活性。 如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用共激活因子；

8、與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用共阻遏因子。常見轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域 (domain)組成DNA結(jié)合域 （DNA binding domain)Basic AA (K/R) rich, positively charged轉(zhuǎn)錄激活域(trans-activation domain)TF蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域（dimerization, co-factors） 谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域 (D/E-rich)脯氨酸(P)富含域最常見的DNA binding domain鋅指(zinc finger)C CysH His常結(jié)合GC boxbHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)同源域(H

9、omeodomain)蛋白通過其第三個螺旋與雙鏈DNA的大溝相結(jié)合，其N端的延伸部分則與DNA的小溝相結(jié)合，提高了穩(wěn)定性 常見的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域 真核基因表達(dá)調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是復(fù)雜的、多樣的網(wǎng)絡(luò)*不同的DNA元件組合可產(chǎn)生多種類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式。*多種轉(zhuǎn)錄因子又可結(jié)合相同或不同的DNA元件。*轉(zhuǎn)錄因子與DNA元件結(jié)合后，對轉(zhuǎn)錄激活過程所產(chǎn)生的效果各異，有正性調(diào)節(jié)或負(fù)性調(diào)節(jié)之分。真核基因表達(dá)的多級調(diào)控組蛋白修飾DNA甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄后加工mRNA降解蛋白質(zhì)降解蛋白質(zhì)翻譯翻譯后修飾1.染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)主要依賴于輔助調(diào)節(jié)因子對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。輔助調(diào)節(jié)子通過三種方式對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)起調(diào)節(jié)作用：1）依

10、賴于ATP 的核小體重建復(fù)合體（ADRC）：它們依靠水解ATP 所產(chǎn)生的能量來改變核小體的相對位置，將DNA 序列暴露出來，使轉(zhuǎn)錄因子能夠與之結(jié)合。這是一個物理過程，染色質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)并沒有變化，只改變核小體的相對位置。2）組蛋白修飾：主要通過共價修飾組蛋白的末端來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。當(dāng)構(gòu)成染色質(zhì)的組蛋白發(fā)生修飾時，就會影響染色質(zhì)的構(gòu)型，而結(jié)構(gòu)的變化引起基因轉(zhuǎn)錄活性的變化。3）DNA甲基化：真核DNA約有5%的胞嘧啶被甲基化。一般而言，DNA甲基化抑制基因表達(dá)。 甲基化預(yù)測在我們的基因組中，發(fā)生甲基化的DNA影響基因的開關(guān)?；虮磉_(dá)能夠推斷與我們的身份相關(guān)聯(lián)的幾種屬性，如性別、種族、年齡和健康，甚至

11、童年時代經(jīng)歷。Factors underlying variable DNA methylation in a human community cohort. Lucia L. Lama, et al. doi: 10.1073/pnas.11212491092.DNA水平的調(diào)節(jié) 真核基因一般都處于阻遏狀態(tài)，RNA聚合酶對啟動子的親和力很低。 通過利用各種轉(zhuǎn)錄因子正性激活RNA聚合酶是真核基因調(diào)控的主要機(jī)制。3.RNA水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工：真核基因大多為斷裂基因，內(nèi)含子和外顯子一起被轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物經(jīng)剪接（包括可變剪切,alternative splicing）、加帽、加尾等加工修飾，才能轉(zhuǎn)變

12、為成熟的mRNA 。RNA降解：包括非特異性降解（RNase, exosome)和特異性降解(NMD，RNAi)。4.蛋白水平的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成:ribosome蛋白翻譯，構(gòu)像折疊，細(xì)胞內(nèi)定位蛋白質(zhì)修飾:包括磷酸化(phosphorylation),乙?；?acetylation)，甲基化(methylation),糖基化(glycosylation),etc蛋白降解：包括非特異性降解（protease, peroxisome， vacuole)和特異性降解(Ubiquitin/proteasome system,下下次課具體講)。真核基因表達(dá)調(diào)控的主要步驟 染色質(zhì)去組裝蛋白質(zhì)修飾生化功能真核基

13、因轉(zhuǎn)錄后的加工 1.真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特點： 含內(nèi)含子，需經(jīng)剪接去除； 需要修飾（加帽、加尾，稀有堿基）； 轉(zhuǎn)錄和翻譯是兩個相對獨立的過程。 2.加工類型: 加帽、加尾 修飾甲基化、?；?剪接 RNA編輯RNA加工的意義： 活化使無活性的前體RNA加工成有活性的成熟RNA；（rRNA、tRNA的剪接、修飾） 改變基因的編碼產(chǎn)物同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，不同剪接方式，編輯方式，蛋白產(chǎn)物不同； 調(diào)節(jié)方式加工會影響RNA的活性、半衰期、運輸?shù)?，影響RNA功能的發(fā)揮； 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因在核漿中被轉(zhuǎn)錄，RNA分子很大，且很不穩(wěn)定，由于大小很不一致，稱為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA），其中mRNA是由hnRNA

14、加工成的。hnRNA 25%mRNA 75%在核內(nèi)降解 hnRNA先加帽， hnRNA尾端被切去一段后，加poly（A）尾，切除內(nèi)含子成為mRNA，進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)。加帽 ( Cap0、CapI、CapII三種帽子結(jié)構(gòu) ) 在細(xì)胞核中進(jìn)行，hnRNA的5端常為GTP，帽子化過程后，形成m7G5ppp5Np結(jié)構(gòu)。 5帽子的功能： 保護(hù)mRNA免受5-核酸外切酶降解； 使mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)； 對翻譯起識別作用（ m7G5ppp5Np 優(yōu)先與核糖體結(jié)合）。 三種帽結(jié)構(gòu)初級轉(zhuǎn)錄物的切除與多聚腺苷酸化RNA splicing and editing剪接splicing 把斷裂基因轉(zhuǎn)錄本中的內(nèi)含子除去真核生物

15、基因是斷裂基因(split gene) 外顯子(exon)與內(nèi)含子(intron)Alternative promoters & RNA splicing - essentially disproved the older notion that a single gene sequence encoded a single protein圖8-9 可變剪接導(dǎo)致-淀粉酶基因在不同組織中的表達(dá)差異 內(nèi)含子的剪接方式 自我剪接（由RNA分子本身完成 ）：型 型 剪接體SnRNP參與mRNA 酶蛋白參與的剪接tRNASnRNA參與的mRNA前體的剪接自我剪接與剪接體催化的剪接比較Inhibition

16、 of RNA Helicase Brr2 by the C-Terminal Tail of the Spliceosomal Protein Prp8. Science, May 23 2013; DOI: 10.1126/science.1237515mRNA的不同剪接產(chǎn)物 在某些生物中，在不同分化時期，RNA種類無區(qū)別，基因表達(dá)差異靠加工實現(xiàn)，如海膽卵母細(xì)胞。 不同剪接方式： 產(chǎn)物中少一個外顯子； 產(chǎn)物中外顯子不同； 內(nèi)含子保留； 5剪接點改變； 3剪接點改變。剪接錯誤造成貧血病RNA編輯(RNA editing) DNA上不存在，在RNA產(chǎn)物中插入或刪除幾個堿基的現(xiàn)象。 類型： U的

17、插入和刪除； G/C/A的插入（改變其閱讀框）； CU互變 改變密碼子，構(gòu)建終止密碼。 是基因表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制RNA的編輯(RNA editing) 大多數(shù)mRNA中缺少適當(dāng)?shù)?、完整的起始密碼，不能正確起始翻譯，經(jīng)編輯后可生成成熟mRNAmRNA甲基化 m6A新發(fā)現(xiàn)，20%的人類mRNA 中N6-甲基A腺苷(m6A），存在5000多個不同的mRNA分子中。包括許多人類疾病基因編碼的mRNA中，包括癌癥以及一些大腦疾病，如孤獨癥、阿爾茨海默病、精神分裂癥。RNA甲基化是一種可逆修飾，參與大量生物學(xué)通路和生理過程。mRNA甲基化缺陷引起疾病。肥胖癥風(fēng)險基因FTO突變的人m6A水平低下，食物

18、攝入和代謝異常，從而導(dǎo)致肥胖。據(jù)估計，全球10億人有FTO突變，此突變是肥胖癥及2型糖尿病的主要病因Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3 UTRs and near Stop Codons. Kate D. Meyer, et al. doi:10.1016/j.cell.2012.05.003熒光原位 RNA 測序（FISSEQ） Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ. Science, 27 February 2014; 環(huán)狀

19、RNA影響基因表達(dá)Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature , 27 February 2013 Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature, 27 February 2013內(nèi)含子的互補(bǔ)序列介導(dǎo)了外顯子環(huán)化環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，也是RNA領(lǐng)域最新的研究熱點。與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA，含5和3末端）不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不

20、受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）結(jié)合位點，在細(xì)胞中起到miRNA海綿（ miRNA sponge）的作用，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平；這一作用機(jī)制被稱為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制。通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用， circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用Xiao-Ou Zhang, Hai-Bin Wang, Yang Zhang, Xuhua Lu, Ling-Ling Chen, Li Yang. Complementary Sequence-Mediat

21、ed Exon Circularization. Cell, September 18, 2014; DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.001 維生素對基因表達(dá)和生理機(jī)能的影響Interspecies Systems Biology Uncovers Metabolites Affecting C. elegans Gene Expression and Life History Traits. Cell, 13 February 2014冥想可改變基因表達(dá)？Richard Davidson ,Psychoneuroendocrinology缺乏睡眠可能改變基因表達(dá)Eff

22、ects of insufficient sleep on circadian rhythmicity and expression amplitude of the human blood transcriptome. PNAS, February 25, 2013David BaulcombeFor the discovery of RNA interference gene silencing by dsRNA and small RNAfunctional RNA transcripts ( tRNA, rRNA, miRNA)MicroRNAs (miRNAs) can regula

23、te gene expressionRNAiNature Reviews Molecular Cell Biology 8: 2336 (2007)siRNAmiRNARNA acts as a regulator of gene expression-gene silencing microRNA大多數(shù)的microRNA是通過Drosha將長鏈的原始轉(zhuǎn)錄本剪切成約含有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的65個堿基的microRNA前體，再由Dicer將其加工為含有約22個堿基的雙鏈成熟microRNA。成熟的microRNA與Argonaute蛋白復(fù)合體結(jié)合，通過不完全配對靶向mRNA，阻遏翻譯。 mse-tsRNA

24、s成熟精子中大量存在一類來源于tRNA的小分子RNA。這類小RNA的長度主要富集于29-34nt，類似但不同于睪丸中的piRNA；命名為mse-tsRNAs (mature-sperm-enriched tRNA derived small RNAs)。mse-tsRNAs的含量占小鼠精子小RNA測序reads總量的67.54%； mse-tsRNAs在成熟精子頭部富集，說明其能夠在受精時進(jìn)入卵細(xì)胞, 可能作為一種古老的父源信息在受精時傳遞給卵細(xì)胞。A novel class of tRNA-derived small RNAs extremely enriched in mature mou

25、se sperm. Hongying Peng, et al., cell research, 2012/10/09RNA到RNA的復(fù)制人類細(xì)胞中的所有RNA都從DNA模版復(fù)制.從RNA到RNA的復(fù)制機(jī)制，只存在于植物和酵母菌中，與一種名為RNA依賴性RNA聚合酶（簡稱RdRP）有關(guān)，這種酶參與關(guān)鍵性細(xì)胞調(diào)控程序。研究發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中有數(shù)千種能直接復(fù)制的sRNA。 New class of gene-termini-associated human RNAs suggests a novel RNA copying mechanism. Philipp et al. Nature doi:10

26、.1038/nature09190RNA降解機(jī)制在 RNA 分子合成過程中發(fā)生任何的錯誤，或是不必要的 RNAs 累積對于細(xì)胞都是有害的。因此清除有缺陷或是不再需要的 RNAs 是細(xì)胞代謝的一個關(guān)鍵步驟。RNA 分子常常發(fā)生折疊。為了讓外來體降解 RNA ， RNA 分子必須首先解折疊這一任務(wù)由 Ski 復(fù)合物完成。解折疊的 RNA 分子隨后被引導(dǎo)通過連接通道到達(dá)外來體。這一 Ski 復(fù)合物將 RNA 分子提供給外來體。 Felix Halbach, Peter Reichelt, Michaela Rode, Elena Conti. The Yeast Ski Complex: Cryst

27、al Structure and RNA Channeling to the Exosome Complex. Cell, 15 August 2013; DOI: 10.1016/j.cell.2013.07.017 Contemporary concept of gene expression regulationInformation encoded in DNA is more complex than previously realized: Alternative promoters RNA splicing Non-coding repetitive DNA overlapping DNA sequences Trans-acting gene enhancers located on different