中科大【生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理】重組蛋白的SDS-PAGE

1、實(shí)驗(yàn)八 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量李衛(wèi)芳 汪文捷 王秀海1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法的基本原理。1.2 初步掌握應(yīng)用此法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的操作技術(shù)。1.3 掌握考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)。 紙電泳瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳毛細(xì)管電泳NativeSDSIEF2DClassification2 實(shí)驗(yàn)原理SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），1967年由Shapiro等建立1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善用于測(cè)蛋白質(zhì)亞基分子量 SDS電泳系統(tǒng)中引入了SDS和還原劑，如-巰基乙醇和二硫蘇糖醇（DTT） 。SDS 是一種陰離子

2、去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白去折疊變性，多聚體解聚為亞基。還原劑能斷開(kāi)鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵，使蛋白質(zhì)以單鏈形式存在。解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。其形狀為長(zhǎng)橢圓棒狀，短軸的長(zhǎng)度都一樣，約為18 ，而長(zhǎng)軸長(zhǎng)度與蛋白質(zhì)分子量成正比。 在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4g SDS/1 g蛋白質(zhì)SDS的硫酸根帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷，因而屏蔽了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異，從而使蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而

3、與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)，這樣便能直接從電泳遷移率計(jì)算出蛋白質(zhì)的分子量。 凝膠濃度與孔徑的關(guān)系：T濃度大，孔徑小，移動(dòng)顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔阻力大。T濃度小，孔徑大，移動(dòng)顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔阻力小。凝膠濃度與被分離物分子量的關(guān)系： 由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過(guò)可移動(dòng)顆粒的分子量也不同.在分子量15 KD-200 KD范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，即：lgMW = K- bmRMW 為蛋白質(zhì)分子量K為截距b為斜率mR為相對(duì)遷移率在一定條件下，K和b均為常數(shù)相對(duì)遷移率 =根據(jù)上述方程將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)作圖，可制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出同樣條件下待測(cè)蛋白質(zhì)的電泳遷移率，即

4、可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量本法測(cè)定分子量的誤差約為10%?？捡R斯亮藍(lán)命名是為紀(jì)念1896年被英國(guó)占領(lǐng)的阿散提部落首府Kumasie（Coomassie）。染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纖維素膜電泳，并認(rèn)為同樣可用于紙電泳，瓊脂糖電泳和淀粉凝膠電泳。1965年Meyer等將此方法應(yīng)用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。 考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)考馬斯亮藍(lán)是一種氨基三苯甲烷染料，通過(guò)范德華力與NH3+的靜電引力，與蛋白質(zhì)形成緊密而非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物。R-250即三苯基甲烷，紅藍(lán)色，每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3H基團(tuán)，偏酸性，與氨基黑一樣結(jié)合到蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。G-250即二甲花青亮藍(lán)，呈藍(lán)綠色，是一種甲基

5、取代的三苯基甲烷。使用時(shí)，考馬斯亮藍(lán)在甲醇-冰醋酸-水 （50：10：40， V/V）混合液中的濃度通常為0.05%0.1%，而且應(yīng)該在加冰醋酸和水之前將它們先溶于甲醇。靈敏度：考馬斯亮藍(lán)染色可以達(dá)到0.2 0.5 g（200 500 ng），最低可檢出0.1 g蛋白；通過(guò)考染條帶的深淺粗細(xì)，可以大致判斷該條帶有多少蛋白。銀染的靈敏度比考染高將近100倍，最低可以檢出2 ng蛋白。蛋白質(zhì)完全變性二硫鍵全部還原與SDS充分結(jié)合 樣品處理目前使用最多的是Laemmli的Tris-甘氨酸系統(tǒng)，廣泛地用于蛋白質(zhì)亞基分子量以及純度的測(cè)定。蛋白質(zhì)的二硫鍵是否完全被還原。只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原

6、的情況下，SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去，并使之具有相同的構(gòu)象。所以樣品處理時(shí)需加-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）。樣品處理液中SDS單體的濃度:為了保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，溶液中SDS的總量至少要比蛋白質(zhì)高3-4倍，甚至10倍以上。樣品處理液的離子強(qiáng)度：應(yīng)保持較低的離子強(qiáng)度（低于0.26），這樣才能保證SDS有較高的單體濃度，與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。若樣品的離子強(qiáng)度太高，需先透析或凝膠過(guò)濾除鹽。樣品中的蛋白質(zhì)濃度需適當(dāng)。濃度過(guò)高，易造成拖尾，甚至影響蛋白質(zhì)遷移率與分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系；濃度太低則不易檢測(cè)。通常根據(jù)樣品含有的蛋白質(zhì)種類多少及所使用的檢測(cè)方法確定蛋白質(zhì)濃度，如用考馬斯亮藍(lán)染

7、色，每種蛋白的濃度應(yīng)為2030g/ml,若用銀染，則只需0.30.5g/ml。二硫蘇糖醇（DTT） 0.75g(或-巰基乙醇) 1ml10%SDS 10 ml1M Tris-Cl pH6.8 1.6 ml87%甘油 6.25 g0.05%溴酚藍(lán) 2mlddH2O 至20ml1 ml/管分裝，20保存。 樣品緩沖液（0.08M Tris-Cl， pH6.8） 5用樣品緩沖液（0.08M Tris-Cl， pH6.8）配制成每種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度均為0.5 g /ul的溶液，-20保存。使用前置室溫融化后，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。配置貯備溶液 A30%Acr/0.8%Bis 貯液： Acr30

8、g Bis0.8 g溶于去離子水，定容至100 ml。棕色瓶4保存。B.4分離膠緩沖液（1.5 M Tris-Cl pH 8.8；0.4% SDS）：Tris Base：181.8 g； SDS：4 g； ddH2O 750 mlHCl 加至pH 8.8ddH2O 至 1000 mlC.4濃縮膠緩沖液（1M Tris-Cl pH6.8 ；0.4% SDS ）：Tris Base：30.3 g； SDS：4 g； ddH2O 200 mlHCl 加至pH6.8 ddH2O 至250 mlD.10 % AP：AP 1gddH2O 至10 mlE.TEMEDF.10SDS電極緩沖液(PH8.3)：T

9、ris base (FW121.1) 250 mMGlycine (FW 75.1) 2MSDS (FW288.4) 1% (W/V) ddH2O to 100mL G.固定染色液：考馬斯亮藍(lán)R-250 0.58g 95%乙醇 250mL冰醋酸 50 ml ddH2O 200 ml L.脫色液：95%乙醇 250 ml冰醋酸 80 ml ddH2O1000 ml3.1 安裝垂直板電泳槽3.2 分離膠制備12%, 配5 ml,加至距梳齒0.5 cm，上覆蓋12 mm高的蒸餾水(或無(wú)水乙醇、水飽和的異丁醇) ，用于隔絕空氣，使膠面平整，靜置20 分鐘-30 分鐘使其聚合。3.3 濃縮膠制備5%，配

10、 2 ml,插入加樣梳，靜置20 分鐘-30 分鐘使其凝合。3. 試驗(yàn)操作試劑用量 (mL)12%分離膠5%濃縮膠4分離膠緩沖液(PH8.8)1.254濃縮膠緩沖液(PH6.7)0.530% 丙烯酰胺貯液20.33ddH2O1.71.1510% 過(guò)硫酸胺（AP）0.050.02TEMED0.0050.0023.4 上樣與電泳 將電泳槽與電泳儀連接好， 上槽接負(fù)極，下槽接正極。 上下槽中加滿電極緩沖液， 移液槍或微量注射器加樣，每孔10 l。 電泳條件：開(kāi)始電壓90 V,待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，恒壓130 V，電泳約2 h,直至前沿距下端約0.2 cm。加樣：標(biāo)準(zhǔn)蛋白 (marker)：5 lE.C

11、oli lysis ：10 lPurified protein (OpuCC): 10 l注意：10 l電泳樣品加入2.5 l 5Loading Buffer(5LB)后，要在沸水浴中煮35 min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。 3.5 凝膠板剝離與固定 電泳結(jié)束后，關(guān)閉電泳儀。用不銹鋼藥鏟撬開(kāi)玻璃板，取出膠膜。4.7 染色與脫色 加入染色液，微波爐內(nèi)煮沸 1.5-2 min；or 室溫下染色1 h；Or 60 水浴染色10 min。然后用脫色液脫色，更換脫色液3-4次，直至背景無(wú)色為止。4.1 電泳遷移率的計(jì)算4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.3 待測(cè)