選修1土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù) 完整版PPT

1、專題2微生物的培養(yǎng)與應用課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù) 課題背景1、尿素的利用 尿素是一種重要的農業(yè)氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3脲酶 H2O尿素: CO(NH2)23、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌；某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌；統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌。一、研究思路、篩選菌株、統(tǒng)計菌落數(shù)目、設置對照1、實例： 尋找目的菌

2、種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物，只有Taq細菌被篩選出來。 DNA多聚酶鏈式反應（PCR)是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。、篩選菌株 科學家在熱泉中找到了耐熱細菌Taq，并從水生耐熱細菌Taq中分離到耐高溫的Taq DNA聚合酶。 去哪里尋找這種耐高溫的DNA聚合酶？ 為什么Taq細菌能從熱泉中被篩選出來？啟示： 利用選擇培養(yǎng)基分離。在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。實例 例1、固氮微生物：用無氮培

3、養(yǎng)基分離； 例2、酵母菌和霉菌:用含青霉素的培養(yǎng)基分離； 例3、分解尿素的細菌：用尿素是唯一氮源的培養(yǎng)基分離。2、實驗室中微生物的篩選原理： 人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。、篩選菌株方法：瓊脂 15.0g尿素CO(NH2)2 1.0g葡萄糖 10.0gMgSO47H2O 0.2gNaH2PO4 2.1g KH2PO4 1.4g3、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：、篩選菌株培養(yǎng)基組成 H2O定容至1000ml3、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質看，此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上看，此培養(yǎng)基屬于哪類？、篩選菌

4、株在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？思考瓊脂 15.0g尿素CO(NH2)2 1.0g葡萄糖 10.0gMgSO47H2O 0.2gNaH2PO4 2.1g KH2PO4 1.4g3、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：、篩選菌株培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng) H2O定容至1000ml無機鹽碳源氮源凝固劑氫元素、氧元素碳源 固體培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 尿素是唯一氮源 培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。 不能合成脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基篩選分解尿素的微生物的原理、

5、篩選菌株1、顯微鏡直接計數(shù)： 利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。、統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點：2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）常用方法：稀釋涂布平板法。原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。、統(tǒng)計菌落數(shù)目： 為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。 為使結果接近真實值，可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中（設立重復組），經涂布，培養(yǎng)，計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實

6、際數(shù)目低。這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。、統(tǒng)計菌落數(shù)目：2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）(稀釋涂布平板法)注意事項、統(tǒng)計菌落數(shù)目：2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）(稀釋涂布平板法) P22實例第一位同學稀釋度第二位同學106 （M）106 （M）1132菌落數(shù) 平板平板23021212256平均值 163 （C）討論你認為哪位同學的結果更接近真實值？你認為這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，怎樣改進？2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）(稀釋涂布平板法)每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M

7、代表稀釋倍數(shù)。、統(tǒng)計菌落數(shù)目：P22想一想，如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測每克樣品中的菌落數(shù)？ 統(tǒng)計某一稀釋度（M）下平板上生長的菌落數(shù)，最好統(tǒng)計3個平板，計算出平板上的菌落數(shù)的平均值（C），然后按以下公式進行計算。計數(shù)法直接計數(shù)法、平板計數(shù)法、比濁法、膜過濾法、統(tǒng)計菌落數(shù)目：例題：統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法有 （ ）A. B. C. D.D涂布平板法 重量法 直接計數(shù)法 比濁法 生理指標法 膜過濾法 是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。、設置對照： 在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的

8、稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析A同學的結果。 土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質) 是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗。1、對照實驗2、設置對照的主要目的原因： P23實例小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗 方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣（未接種）的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。、設置對照：（一）、土壤取樣（二）、制備培養(yǎng)基二、設計實

9、驗（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察（三）、樣品的稀釋（四）、取樣涂布（一）、土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）、制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。二、設計實驗應在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板（三）、樣品的稀釋 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋

10、范圍相同嗎？這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。P24 土壤中的細菌總量肯定多于土壤中能分解尿素的細菌的總量，因此選用的稀釋范圍肯定不同。實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需

11、要重新實驗。（四）、取樣涂布2、在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。 1、培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：3037培養(yǎng)12d放線菌：2528培養(yǎng)57d霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察3、一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下，（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征（包括形態(tài)、大小、隆起程度和顏色）。（五）、微生物的培養(yǎng)與觀察三、結果分析與評價1、是否有雜菌污染3、樣品的稀釋操作4、重復組的結果2、選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落1.通過對照實

12、驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。三、結果分析與評價四、操作提示 無菌操作 做好標記 規(guī)劃時間 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。五、課外延伸CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3 H2O脲酶細菌合成脲酶，將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基堿性增強， PH升高，因此，可通過檢測PH的變化來判斷該化學

13、反應是否發(fā)生。2、方法：1、原理：對分裂的菌種作進一步的鑒定用生物化學方法鑒定測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。五.課外延伸鑒定大腸桿菌大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征 大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤本課題知識小結:1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素實踐訓練CD3.下列說法不正確的是（ ） A.科學家從7080度熱泉中分離到耐高