植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)(55張)課件

1、植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)(55張)課件植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)(55張)課件1983年，日本三井石油化學(xué)工業(yè)公司在世界上首次成功地采用紫草細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)紫草寧。1983年，日本三井石油化學(xué)工業(yè)公司在世界上首次成功地采用紫北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司/index.html北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司/i1 植物次生代謝產(chǎn)物概述 2 細(xì)胞的初代培養(yǎng) 3 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選 4 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法 5 植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)1 植物次生代謝產(chǎn)物概述1.1 植物代謝產(chǎn)物（1）初生代謝：為維持植物正常的生長發(fā)育所必須的代謝。初生代謝過程中形成的各種產(chǎn)物為初生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物不

2、穩(wěn)定，在體內(nèi)容易發(fā)生轉(zhuǎn)化。（2）次生代謝：建立在初生代謝基礎(chǔ)上，對(duì)于植物的正常生長發(fā)育非必需的代謝，其代謝產(chǎn)物為次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物是末端代謝產(chǎn)物，比較穩(wěn)定，可以在體內(nèi)積累。1.1 植物代謝產(chǎn)物 類別 次生代謝產(chǎn)物 用途 黃酮 銀杏黃酮，大豆黃酮 治療心血管疾病 醌 紫草寧 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 簡單酚類 香豆素 香料，抗菌消炎萜 類 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗瘧疾生 物 堿 長春新堿 抗癌 奎寧 抗瘧疾酚類化合物 類別 次生代謝產(chǎn)物 用途酚類化合物長春堿： 2 million/kg長春新堿： 15million/kg長春堿： 2 million/kg 李時(shí)珍在本草綱目中所開列的189

3、2種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。天然的次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)超過2萬種。次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用：色素、香料、藥物、添加劑、工業(yè)原料等。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)(55張)課件植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)(55張)課件紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus brevifolia的樹皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來源于紅豆杉屬植物紫杉醇簡介紫杉醇：二萜類化合物紫杉醇簡介市場需求抗癌一線用藥銷售額年增長率5億美元 理論需求量 2g /人, 500萬人/年 1000kg/年實(shí)際銷量350 k

4、g/年紫杉醇供需相差十分懸殊 圖1：國際紫杉醇原料藥需求走勢(shì)圖（單位：公斤）圖2：國際紫杉醇銷售額（億美元）市場需求抗癌一線用藥紫杉醇供需相差十分懸殊 圖1：國際紫杉醇藥源問題紅豆杉 主要原料植物 國家一級(jí)保護(hù)野生植物，全球十大瀕危物種之一生長緩慢 分布有限 Taxol含量低 樹皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵樹=10噸樹皮=1kg Taxol=500病人700歲的紅豆杉慘遭剝皮藥源問題紅豆杉700歲的紅豆杉慘遭剝皮人工栽培 采用種子繁殖、扦插等無性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋找紅豆衫的替代物 從紅豆杉非樹皮部位提取 產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物藥源問題解決辦

5、法（一）人工栽培藥源問題解決辦法（一）藥源問題解決辦法（二）化學(xué)合成全合成 1994年獲得成功 現(xiàn)有六種途徑半合成 以10-DAB和Baccatin 作為半合成原料獲得紫杉醇藥源問題解決辦法（二）化學(xué)合成藥源問題解決辦法（三）生物方法組織和細(xì)胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成 研究階段 紅豆杉生物合成途徑基本明確 10種相關(guān)酶基因被克隆表達(dá) 利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量 藥源問題解決辦法（三）生物方法1.2 獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法從植物中提取化學(xué)合成植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物植物細(xì)胞具有形態(tài)全能性，化學(xué)全能性（在離體的條件下可以合成整株植物能合成的物質(zhì)）1.2 獲得植物次生代謝產(chǎn)

6、物的方法從植物中提取化學(xué)合成植物細(xì) 自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式 生產(chǎn)周期 紫草寧含量（干重）完整植物 23年 12植物細(xì)胞培養(yǎng) 3周 14 細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的理想途徑：縮短周期，提高生產(chǎn)效率植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)周期為15-30d；而完整植株生長短則幾個(gè)月，長則數(shù)年，如木瓜8個(gè)月，而紫草為5年易于管理，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度培養(yǎng)在無菌條件下進(jìn)行，可排除病蟲害干擾可探索新的合成路線，獲得新的有用物質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的理想途徑：1.3 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：即是將植物細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)。1.3 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：即是將植物細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)在液體培成功

7、的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足3個(gè)條件：分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在 3050個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。細(xì)胞分裂快，均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。有效成分含量高。次生產(chǎn)物的產(chǎn)量=細(xì)胞量*細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率可控遺傳因素決定成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足3個(gè)條件：次生產(chǎn)物的產(chǎn)量=細(xì)胞 植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長、細(xì)胞抗剪切能力弱、易聚團(tuán)等特點(diǎn)。 植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)不僅要考慮有利于細(xì)胞生長，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離。 適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的

8、流動(dòng)性和較低的剪切力。 植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長、細(xì)胞抗剪切能力弱、易聚團(tuán)等2 細(xì)胞的初始培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中獲得適宜于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系的過程稱為細(xì)胞的初始培養(yǎng)。2.1建立懸浮系獲取懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞的振蕩培養(yǎng)酶解法愈傷組織培養(yǎng)法使細(xì)胞團(tuán)分散促進(jìn)氣體交換2 細(xì)胞的初始培養(yǎng)獲取懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞的振蕩培養(yǎng)酶解法愈傷攪拌培養(yǎng)； 旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)； 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)培養(yǎng)方式：攪拌培養(yǎng)； 旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)； 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2.2 建立良好的懸浮系的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 1. 選擇適宜的外植體雙子葉植物：幼胚、成熟胚、下胚軸、葉片單子葉植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花藥等2.2 建立良好的懸浮系的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 2. 誘導(dǎo)疏松愈傷組織； 培養(yǎng)基 愈傷組織的異

9、質(zhì)性； 繼代培養(yǎng) 3. 選擇適宜的培養(yǎng)基； 基本培養(yǎng)基+CTK/AUX+天然復(fù)合物 eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE 培養(yǎng)基的PH 2. 誘導(dǎo)疏松愈傷組織；李忠光，龔明. 2006.7李忠光，龔明. 2006.74. 懸浮培養(yǎng)初期的控制 轉(zhuǎn)速，光，溫度5. 懸浮細(xì)胞的繼代與選擇 繼代中收集小的細(xì)胞團(tuán) 條件培養(yǎng)基：新鮮培養(yǎng)基4. 懸浮培養(yǎng)初期的控制3 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選(P113)3.1高產(chǎn)細(xì)胞系 篩選的整體思路外植體愈傷組織的誘導(dǎo)篩選懸浮培養(yǎng)細(xì)胞高產(chǎn)細(xì)胞系篩選3 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選(P113)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)篩選懸浮高產(chǎn)細(xì)胞系的建立高產(chǎn)細(xì)胞株系的特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，

10、以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成的速度快，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累，而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中高產(chǎn)細(xì)胞系的建立高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選過程選定特定起始材料準(zhǔn)確選擇能夠產(chǎn)生目的代謝產(chǎn)物的植物種類、品種或單株應(yīng)盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織或器官為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并獲得單細(xì)胞懸浮液誘變處理細(xì)胞懸浮液，篩選目的突變細(xì)胞通過單細(xì)胞培養(yǎng)突變細(xì)胞，獲得突變細(xì)胞無性系（即突變細(xì)胞愈傷組織獲得）高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選過程高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選方法目測法注意：真正的變異體or生理狀態(tài)不同的細(xì)胞克隆根據(jù)單細(xì)胞克隆次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行篩選抗性篩選如：添加抗性抑制劑 庚二酸

11、-生物素誘變篩選高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選方法3.2 高產(chǎn)系的穩(wěn)定性及保存方法盡量減少繼代次數(shù)，用礦物油包埋法，低溫保存法（0-4），超低溫保存法（-196 ）保存。同時(shí)從高產(chǎn)系中不斷克隆形成新的高產(chǎn)細(xì)胞系。3.2 高產(chǎn)系的穩(wěn)定性及保存方法4 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法懸浮培養(yǎng)：將游離的細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)按一定密度，懸浮在液體培養(yǎng)基中，不斷攪拌或者振蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞快速、大量增殖。技術(shù)難點(diǎn)：通氣、剪切力的適應(yīng)性；細(xì)胞同步化控制。培養(yǎng)：培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基+CTK/AUX 培養(yǎng)條件：溫度、氧氣、PH、轉(zhuǎn)速同步化控制細(xì)胞增殖的監(jiān)測，適時(shí)測定細(xì)胞的數(shù)量，掌握放罐時(shí)機(jī)。4 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法4.1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法(

12、P117) 分批培養(yǎng)法 連續(xù)培養(yǎng)法 半連續(xù)培養(yǎng)法 細(xì)胞固定化培養(yǎng)4.1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法(P117)分批培養(yǎng)：把細(xì)胞分散在一定溶積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。注：中途不添加也不更換培養(yǎng)基設(shè)備簡單，操作方便，重復(fù)性好。適合與突變體篩選和遺傳轉(zhuǎn)化的研究。分批培養(yǎng)：把細(xì)胞分散在一定溶積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)備簡單，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖曲線 時(shí)間（d）細(xì)胞數(shù)量123451滯后期、 2對(duì)數(shù)生長期3直線生長期 、4減緩期5靜止期（1）細(xì)胞擴(kuò)增生長成S形曲線（2）繼代培養(yǎng)：要求縮短滯后期 滯后期的長短：a 繼代細(xì)胞所處的生長時(shí)期；對(duì)數(shù)期 b 繼代的細(xì)胞密度 104-105個(gè)/ml懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖曲線 時(shí)間（d）細(xì)胞數(shù)

13、量123451連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng) 器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時(shí)以 一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基及培養(yǎng)物的方式。加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng)加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培半連續(xù)培養(yǎng)：在完成分批培養(yǎng)的一個(gè)周期 后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，只 保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的 種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 的方式。細(xì)胞固定化培養(yǎng)：將細(xì)胞固定在固相基質(zhì)上，放入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)的方式。半連續(xù)培養(yǎng)：在完成分批培養(yǎng)的一個(gè)周期懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器的類型： 機(jī)械攪拌式反應(yīng)器 氣動(dòng)式反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)氣升式外循環(huán)氣升式內(nèi)循環(huán)氣升式外循環(huán)氣升式機(jī)械攪拌式機(jī)械攪拌

14、式內(nèi)循環(huán)氣升式內(nèi)循環(huán)氣升式外循環(huán)氣升式外循環(huán)氣升式4.2 培養(yǎng)基：與培養(yǎng)的細(xì)胞密度相關(guān)（1）高密度懸浮系（5*104個(gè)/ml）a 用B5，ER等專用培養(yǎng)基b 對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)基做出改良如：加大2,4-D用量；改良MS，加入VB、CH等天然復(fù)合物（2）低密度懸浮系（5*104個(gè)/ml）a 條件培養(yǎng)基b 向培養(yǎng)基中添加多種成分，盡可能滿足細(xì)胞生長的需要4.2 培養(yǎng)基：與培養(yǎng)的細(xì)胞密度相關(guān)細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的大多數(shù)細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。細(xì)胞培養(yǎng)的同步化方法：饑餓法：限制必需物質(zhì)的供應(yīng)抑制法：化學(xué)抑制，物理抑制分級(jí)培養(yǎng)：細(xì)胞分級(jí)儀4.3 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化(P121)細(xì)胞同步化：

15、同一懸浮培養(yǎng)體系的大多數(shù)細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的4.4 懸浮細(xì)胞的生長量和活力分析(P122)（1）測定懸浮細(xì)胞數(shù)量的方法：細(xì)胞計(jì)數(shù)-血球計(jì)數(shù)板 鮮重、干重的測定細(xì)胞密實(shí)體積(PVC)（2）細(xì)胞活力測定二乙酸熒光素法 （FDA）-活細(xì)胞內(nèi)有熒光產(chǎn)生伊凡蘭染色法-染色受損細(xì)胞核-死細(xì)胞相差顯微鏡法-胞質(zhì)環(huán)流是否存在4.4 懸浮細(xì)胞的生長量和活力分析(P122) 5 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求： 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 從細(xì)胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下3個(gè)條件： 1、

16、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。 2、細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。 3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。 5 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)5.1 技術(shù)路線 (1) 選擇適宜的外植體；誘導(dǎo)疏松愈傷組織； (2) 通過含量分析，選擇高產(chǎn)細(xì)胞系 (3) 研究培養(yǎng)條件（達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)）； (4) 建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、優(yōu)化培養(yǎng)條件 （達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)）； (5) 小試、中試、優(yōu)化培養(yǎng)條件； (6) 大規(guī)模培養(yǎng)； (7) 工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品分離，純化。 5.1 技術(shù)路線5.2 提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（1）篩選高產(chǎn)

17、細(xì)胞系 不同植物種類，不同植株及同一植株的不同部位，往往有不同的代謝能力； 通過人工誘變改良細(xì)胞系； 通過遺傳改良篩選細(xì)胞系。 5.2 提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法云南紅豆杉東北紅豆杉中國紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉云南紅豆杉東北紅豆杉中國紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉 篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因此，還需要定期檢測，更新細(xì)胞株系。 篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有的植物細(xì)胞系其高培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分一方面要滿足植物細(xì)胞的生物量增長，另一方面要使細(xì)胞能合成和積累次生產(chǎn)物。故在生長的第一階段使用生長培養(yǎng)基；第二階段使用生產(chǎn)培養(yǎng)基一般來說增加培養(yǎng)

18、基的N、P和K濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長，而適當(dāng)增加糖濃度則有利于次生產(chǎn)物的合成；而激素需根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定適于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要是B5和ER （2）優(yōu)化培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基+激素+天然復(fù)合物 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分一方面要滿足植物細(xì)胞的生物量增長，另一方面要 （3）改善培養(yǎng)條件 對(duì)于任何一種細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件都要通過多次的試驗(yàn)摸索確定。 eg: 在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。 （3）改善培養(yǎng)條件（4）培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)是以初生代謝物質(zhì)為原料，經(jīng)過一系列的化學(xué)轉(zhuǎn)化而合成的，因此，每種次生代謝產(chǎn)物都有一條生物合成途徑

19、。前體物質(zhì)：次生代謝物質(zhì)生物合成途徑的中間體物質(zhì) 煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質(zhì)煙堿酸加入，會(huì)增加煙堿的生成量。（4）培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)是以初生代謝 第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞分裂）； 第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞指數(shù)生長停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質(zhì)的積累。 （5）二步培養(yǎng)法 第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞分裂）； （5）二（6） 使用誘導(dǎo)子 誘導(dǎo)子是能刺激細(xì)胞合成次生產(chǎn)物的物質(zhì)A 生物誘導(dǎo)子：微生物菌絲、提取物、多糖、蛋白質(zhì)類等；植物細(xì)胞碎片、寡聚糖等B 非生物誘導(dǎo)子：輻射、金屬離子（6） 使用誘導(dǎo)子1、最孤獨(dú)的時(shí)光，會(huì)塑造最堅(jiān)強(qiáng)的自己。2、把

20、臉一直向著陽光，這樣就不會(huì)見到陰影。3、永遠(yuǎn)不要埋怨你已經(jīng)發(fā)生的事情，要么就改變它，要么就安靜的接受它。4、不論你在什么時(shí)候開始，重要的是開始之后就不要停止。5、通往光明的道路是平坦的，為了成功，為了奮斗的渴望，我們不得不努力。6、付出了不一定有回報(bào)，但不付出永遠(yuǎn)沒有回報(bào)。7、成功就是你被擊落到失望的深淵之后反彈得有多高。8、為了照亮夜空，星星才站在天空的高處。9、我們的人生必須勵(lì)志，不勵(lì)志就仿佛沒有靈魂。10、拼盡全力，逼自己優(yōu)秀一把，青春已所剩不多。11、一個(gè)人如果不能從內(nèi)心去原諒別人，那他就永遠(yuǎn)不會(huì)心安理得。12、每個(gè)人心里都有一段傷痕，時(shí)間才是最好的療劑。13、如果我不堅(jiān)強(qiáng)，那就等著別

21、人來嘲笑。14、早晨給自己一個(gè)微笑，種下一天旳陽光。15、沒有愛不會(huì)死，不過有了愛會(huì)活過來。16、失敗的定義：什么都要做，什么都在做，卻從未做完過，也未做好過。17、當(dāng)我微笑著說我很好的時(shí)候，你應(yīng)該對(duì)我說，安好就好。18、人不僅要做好事，更要以準(zhǔn)確的方式做好事。19、我們并不需要用太華麗的語言來包裹自己，因?yàn)槲覀円鲎钫鎸?shí)的自己。20、一個(gè)人除非自己有信心，否則無法帶給別人信心。21、為別人鼓掌的人也是在給自己的生命加油。22、失去金錢的人損失甚少，失去健康的人損失極多，失去勇氣的人損失一切。23、相信就是強(qiáng)大，懷疑只會(huì)抑制能力，而信仰就是力量。24、那些嘗試去做某事卻失敗的人，比那些什么也不

22、嘗試做卻成功的人不知要好上多少。25、自己打敗自己是最可悲的失敗，自己戰(zhàn)勝自己是最可貴的勝利。26、沒有熱忱，世間便無進(jìn)步。27、失敗并不意味你浪費(fèi)了時(shí)間和生命，失敗表明你有理由重新開始。28、青春如此華美，卻在煙火在散場。29、生命的道路上永遠(yuǎn)沒有捷徑可言，只有腳踏實(shí)地走下去。30、只要還有明天，今天就永遠(yuǎn)是起跑線。31、認(rèn)真可以把事情做對(duì)，而用心卻可以做到完美。32、如果上帝沒有幫助你那他一定相信你可以。33、只要有信心，人永遠(yuǎn)不會(huì)挫敗。34、珍惜今天的美好就是為了讓明天的回憶更美好。35、只要你在路上，就不要放棄前進(jìn)的勇氣，走走停停的生活會(huì)一直繼續(xù)。36、大起大落誰都有拍拍灰塵繼續(xù)走。3

23、7、孤獨(dú)并不可怕，每個(gè)人都是孤獨(dú)的，可怕的是害怕孤獨(dú)。38、寧可失敗在你喜歡的事情上，也不要成功在你所憎惡的事情上。39、我很平凡，但骨子里的我卻很勇敢。40、眼中閃爍的淚光，也將化作永不妥協(xié)的堅(jiān)強(qiáng)。41、我不去想是否能夠成功，既然選了遠(yuǎn)方，便只顧風(fēng)雨兼程。42、寧可自己去原諒別人，莫等別人來原諒自己。43、踩著垃圾到達(dá)的高度和踩著金子到達(dá)的高度是一樣的。44、每天告訴自己一次：我真的很不錯(cuò)。45、人生最大的挑戰(zhàn)沒過于戰(zhàn)勝自己！46、愚癡的人，一直想要?jiǎng)e人了解他。有智慧的人，卻努力的了解自己。47、現(xiàn)實(shí)的壓力壓的我們喘不過氣也壓的我們走向成功。48、心若有陽光，你便會(huì)看見這個(gè)世界有那么多美好值

24、得期待和向往。49、相信自己，你能作繭自縛，就能破繭成蝶。50、不能強(qiáng)迫別人來愛自己，只能努力讓自己成為值得愛的人。51、不要拿過去的記憶，來折磨現(xiàn)在的自己。52、汗水是成功的潤滑劑。53、人必須有自信，這是成功的秘密。54、成功的秘密在于始終如一地忠于目標(biāo)。55、只有一條路不能選擇那就是放棄。56、最后的措手不及是因?yàn)楫?dāng)初游刃有余的自己57、現(xiàn)實(shí)很近又很冷，夢(mèng)想很遠(yuǎn)卻很溫暖。58、沒有人能替你承受痛苦，也沒有人能搶走你的堅(jiān)強(qiáng)。59、不要拿我跟任何人比，我不是誰的影子，更不是誰的替代品，我不知道年少輕狂，我只懂得勝者為。60、如果你看到面前的陰影，別怕，那是因?yàn)槟愕谋澈笥嘘柟狻?1、寧可笑著流淚，絕不哭著后悔。62、覺得自己做得到和做不到，只在一念之間。63、跌倒，撞墻，一敗涂地，都不用害怕，年輕叫你勇敢。64、做最好的今天，回顧最好的昨天，迎接最美好的明天。65、每件事情都必須有一個(gè)期限，否則，大多數(shù)人都會(huì)有多少時(shí)間就花掉多少時(shí)間。66、當(dāng)你被壓力壓得透不過氣來的時(shí)候，記住，碳正是因?yàn)閴毫Χ兂砷W耀的鉆石。67、現(xiàn)實(shí)會(huì)告訴你，不努力就會(huì)被生活給踩死。無需找什么借口，一無所有，就是拼的理由。68、人生道路，絕大多數(shù)人，絕大多數(shù)時(shí)候，人都只能靠自己。69、不是某人使你煩惱，而是你拿某人的言行來煩惱自己。70、當(dāng)一個(gè)人真正覺悟的一刻，他放棄追尋外在世界的財(cái)富，而開始追尋他內(nèi)心