植物生物工程實(shí)驗(yàn)二(植物DNA的提取)課件

1、植物生物工程實(shí)驗(yàn)二(植物DNA的提取)課件植物生物工程實(shí)驗(yàn)二(植物DNA的提取)課件實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵参顳NA提取方法，熟悉操作步驟掌握植物大分子操作注意事項(xiàng)及試劑用具準(zhǔn)備方法掌握DNA質(zhì)量紫外分光光度計(jì)檢測方法了解PCR原理，熟悉操作步驟掌握核酸的瓊脂糖電泳檢測方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵参顳NA提取方法，熟悉操作步驟 保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白質(zhì)、多糖等DNA提取的原則實(shí)驗(yàn)原理（DNA提?。?保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性DNA提取的原則實(shí)驗(yàn)原理（DNADNA存在部位主要存在于細(xì)胞核中，線粒體和葉綠體中也少量存在DNA存在部位主要存在于細(xì)胞核中，線粒體和葉綠體中也少量存在基

2、因組DNA的提取 CTAB法 SDS法質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法DNA提取的方法基因組DNA的提取DNA提取的方法在濃氯化鈉溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化鈉溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來.分離得到核蛋白后,需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去,常采用的去除蛋白的方法有3種:用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液,使其乳化,然后離心除去變性蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水

3、相和氯仿相中間,而DNA溶于上層水相.用兩倍體積95%乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來.如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀,得到的是游離的DNA.用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性,與核酸分離,從而從材料中直接提取出DNA.用苯酚處理,然后離心分層,DNA或溶于上層水相,或存在于中間殘留物中,蛋白變性后則停留在酚層內(nèi).吸出上面水層,將其注入兩倍體積的95%乙醇溶液中,得到白色纖維狀DNA沉淀在濃氯化鈉溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很CTAB法原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑， 可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl），

4、該復(fù)合物可溶的 有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)上清加入乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15。CTABCTAB法原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）， CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入 CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 Tris-HCSDS法原理SDS 陰離子去垢劑 高溫（5565）裂解細(xì)胞，蛋白變性，染色體離析高鹽(KA

5、c或NH4Ac) 或降低溫度（冰?。?使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDSSDS法原理SDS 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl SDS 終濃度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDS提取緩沖液的配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pHDNA提取基本步驟材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶 基因組DNA新鮮材料，低溫保存細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長材料準(zhǔn)備 基因組DNA材料準(zhǔn)備基因組DNA材料過多影響裂解，導(dǎo)致DNA量少

6、，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨培養(yǎng)細(xì)胞蛋白酶K細(xì)胞裂解基因組DNA細(xì)胞裂解采用吸附材料吸附分離DNA，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)溶劑（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分而輕柔的混勻離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法核酸分離純化采用吸附材料吸附分離DNA，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系核酸分離純化多糖的去除：多糖水解酶蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑（SDS、異硫氰酸胍等）蛋白酶處理多酚的去除：加入還原劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子

7、的去除：70的乙醇洗滌多糖的去除：蛋白質(zhì)的去除：多酚的去除：預(yù)冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)核酸沉淀 若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解 pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解預(yù)冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀核酸沉淀 若長期儲存建議使用TDNA質(zhì)量檢測紫外分光光度計(jì)檢測法嘌呤和嘧啶的母環(huán)含有共軛雙鍵，因此也有紫外吸收現(xiàn)象，且在260nm和280nm處也存在吸收峰。蛋白質(zhì)中含苯環(huán)的氨基酸在這兩個波長下也會發(fā)生光吸收。因此，通過260nm和280nm下樣品的吸收值比率可判斷核酸純度DNA質(zhì)量檢測紫外分光光度計(jì)檢測法嘌呤和嘧啶的母

8、環(huán)含有共軛A：測DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260mOD230應(yīng)大于2.0。1) OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2) 小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3) OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。 測定結(jié)果分析A：測DNA： 測定結(jié)果分析瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物

9、的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNADNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測，是估計(jì)水平。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色

10、，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，D根據(jù)OD260定量：測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/mlb. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/mlc. oligonucleotide = 33 mg/ml根據(jù)OD260定量：植物生物工程實(shí)驗(yàn)二(植物DNA的提取)課件PCR實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(

11、polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。PCR實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chaiDNA復(fù)制（replication）起始 解旋 引物酶結(jié)合延伸連接終止解鏈方向3353535353353DNA復(fù)制（replication）起始 解旋 引物酶結(jié)植物生物工程實(shí)驗(yàn)二(植物DNA的提取)課件植物生物工程實(shí)驗(yàn)二(植物DNA的提取)課件溫度（）時間（min）94726094變性（1min

12、）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR 反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94變性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。溫度（）時間（min）9494變性（1min）60 退一般PCR反應(yīng)條件一般PCR反應(yīng)條件儀器藥品1.5ml離心管；5ml離心管；研磨棒；5ml吸頭；1000ul吸頭（盒）；200ul吸頭（盒）；10ul吸頭（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30u

13、l移液器；2ul移液器；試劑瓶；量筒恒溫水浴鍋；高速離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；電泳儀；電泳槽；酸度計(jì)；電子天平；PCR儀CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；瓊脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB儀器藥品1.5ml離心管；5ml離心管；研磨棒；5ml吸頭；實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制貯存液最終含量100mlTris（121.14）1 M12.114g1M Tris HCl, pH 8.0先用蒸餾水溶解加至90ml左右，再用HCl調(diào)整pH至8.0，定容至100ml貯存液最終含量100mlEDTA（292.25）0.5 M14.613g0.5M EDTA, pH 8

14、.0先用蒸餾水，再加入NaOH（固體）調(diào)pH至8.0，定容至100ml貯存液最終含量100mlNaCl（58.44）5 M29.22g蒸餾水定容至100ml5M NaCl實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制貯存液最終含量100mlTris（121.1貯存液最終含量100mlCTAB2%2g5M NaCl1.4M28ml0.5M EDTA20mM4ml1M Tris HCl pH8.0100mM10mlPVP1%1g蒸餾水定容至100ml2CTAB貯存液最終含量（10ml）3mlCTAB1g0.3g5M NaCl1.4ml0.42ml蒸餾水8.6ml2.58ml10% CTAB貯存液最終含量100mlCTAB2%2

15、g5M NaCl1.4貯存液最終含量100ml1M Tris HCl, pH 8.010 mM10 ml0.5 M EDTA, pH 8.01 mM2 ml蒸餾水定容至1000 mlT10E1貯存液最終含量（1000ml）100mlTris54g5.4gH3BO427.5g2.75g0.5 M EDTA, pH 8.020ml2 ml蒸餾水定容至100 ml5TBE貯存液最終含量100ml1M Tris HCl, pH 8.異丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB貯存液最終含量（100ml）4.2ml異戊醇4ml168ul氯仿96ml4032ul抽提液1M Tris HCl；0.5

16、M EDTA；5M NaCl；T10E1以及所有需使用的離心管，各種吸頭均需滅菌異丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB貯存液最操作流程操作規(guī)程1.稱取100mg新鮮葉片，置于預(yù)冷1.5ml離心管中，加入液氮，研為細(xì)粉。加入350l新鮮2CTAB緩沖液，再仔細(xì)研磨。（CTAB用于抽提DNA）2.用350l新鮮2CTAB緩沖液，沖洗研磨棒，加入2l巰基乙醇，混勻。65水浴45分鐘，每15分鐘搖動一次。冷卻至室溫，靜置2分鐘。3.每支離心管加入700l氯仿：異戊醇（24：1）（672氯仿:28異戊醇）混合液。輕柔短暫地混和，避免DNA斷裂。顛倒幾次。（氯仿、異戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白質(zhì)

17、）4.在微型離心機(jī)中，以14，000rpm離心5分鐘。移取上層水層，置于新的、標(biāo)識好的1.5ml離心管中。注意避免取到中層物質(zhì)。將氯仿：異戊醇廢液倒入廢液缸。5.加入50l 10CTAB（溶于0.7M NaCl），輕柔混和，并保證混和完全。操作流程操作規(guī)程6.重復(fù)第3、第4步。7.每支離心管中加入等體積異丙醇（400500l）。上下顛倒幾次，4靜置20分鐘（或20，15分鐘）。（異丙醇用于沉淀DNA）8.14，000rpm離心20分鐘。小心倒出上清夜，避免DNA顆粒丟失。倒置離心管，空氣干燥（12分鐘）。9.用1ml70乙醇清洗DNA（3分鐘），14,000rpm離心30分鐘。小心倒出70%乙

18、醇，用1ml 90乙醇清洗DNA，14,000rpm離心30分鐘，小心地倒去乙醇。倒置離心管，空氣中干燥，或用真空泵干燥15分鐘。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10.以150l T10E1或蒸餾水溶解DNA，加入12l不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37反應(yīng)1小時。11.4保存（20長期保存）。6.重復(fù)第3、第4步。冷卻至室 溫2l-巰基乙醇100mg鮮葉水 浴1.5ml離心管液 N2研 磨700l CTAB65，45離 心/15加入700l氯仿：異戊醇（672:28）靜置2min渦旋混和，加入50 l 10CTAB溫和短時514,000 rpm上清夜短時溫和輕柔混和

19、加入等體積異 丙 醇循環(huán)一次離心靜置304，20沉淀離心14,000 rpm20空氣干燥121 ml 70乙醇沉淀314,000 rpm沉淀加入150l T10E11 ml 90乙醇離心14,000 rpm30空氣干燥12l RNAseA37，1h-20保存-20，15冷卻至室 溫冷卻至2l100mg鮮葉水 浴1.5ml離心管液 N2研瓊脂糖凝膠電泳取5TBE緩沖液20mL加水至100mL，配制成1TBE稀釋緩沖液，待用。 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL 1TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為1瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖

20、動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。瓊脂糖凝膠電泳取5TBE緩沖液20mL加水至100mL，配3. 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入1TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。 3. 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩

21、端分別用橡皮膏緊密封住。將加樣：取10L DNA樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。

22、 加樣：取10L DNA樣品與2L 6上樣液混勻，用微量紫外分光光度計(jì)測定核酸濃度的操作步驟a吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。b分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)。c測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d計(jì)算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù) 50/1000；e分析純度。紫外分光光度計(jì)測定核酸濃度的操作步驟a吸取一定量的DNA樣PCR反應(yīng)體系成分體積DNA模板1 ug前向引物(10 uM)1 ul后向引物(10 uM)1 ulMaster Mix (Taq酶+緩沖液+染料)12.5 ulddH2O補(bǔ)至25ulPCR反應(yīng)體系成分體積DNA模板0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸.通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。