植物生物工程實驗二(植物DNA的提取)課件

1、植物生物工程實驗二(植物DNA的提取)課件植物生物工程實驗二(植物DNA的提取)課件實驗目的了解植物DNA提取方法，熟悉操作步驟掌握植物大分子操作注意事項及試劑用具準備方法掌握DNA質量紫外分光光度計檢測方法了解PCR原理，熟悉操作步驟掌握核酸的瓊脂糖電泳檢測方法實驗目的了解植物DNA提取方法，熟悉操作步驟 保證DNA一級結構的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白質、多糖等DNA提取的原則實驗原理（DNA提?。?保證DNA一級結構的完整性DNA提取的原則實驗原理（DNADNA存在部位主要存在于細胞核中，線粒體和葉綠體中也少量存在DNA存在部位主要存在于細胞核中，線粒體和葉綠體中也少量存在基

2、因組DNA的提取 CTAB法 SDS法質粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結合SDS裂解法DNA提取的方法基因組DNA的提取DNA提取的方法在濃氯化鈉溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化鈉溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來.分離得到核蛋白后,需進一步將蛋白等雜質除去,常采用的去除蛋白的方法有3種:用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液,使其乳化,然后離心除去變性蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水

3、相和氯仿相中間,而DNA溶于上層水相.用兩倍體積95%乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來.如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀,得到的是游離的DNA.用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質變性,與核酸分離,從而從材料中直接提取出DNA.用苯酚處理,然后離心分層,DNA或溶于上層水相,或存在于中間殘留物中,蛋白變性后則停留在酚層內.吸出上面水層,將其注入兩倍體積的95%乙醇溶液中,得到白色纖維狀DNA沉淀在濃氯化鈉溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很CTAB法原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑， 可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl），

4、該復合物可溶的 有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質上清加入乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15。CTABCTAB法原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）， CTAB提取緩沖液的經典配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入 CTAB提取緩沖液的經典配方 組份 Tris-HCSDS法原理SDS 陰離子去垢劑 高溫（5565）裂解細胞，蛋白變性，染色體離析高鹽(KA

5、c或NH4Ac) 或降低溫度（冰?。?使蛋白質及多糖雜質沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDSSDS法原理SDS 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl SDS 終濃度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDS提取緩沖液的配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pHDNA提取基本步驟材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟材料準備細胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶 基因組DNA新鮮材料，低溫保存細胞培養(yǎng)時間不能過長材料準備 基因組DNA材料準備基因組DNA材料過多影響裂解，導致DNA量少

6、，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料液氮研磨培養(yǎng)細胞蛋白酶K細胞裂解基因組DNA細胞裂解采用吸附材料吸附分離DNA，應提供相應的緩沖體系采用有機溶劑（酚/氯仿）抽提時應充分而輕柔的混勻離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法核酸分離純化采用吸附材料吸附分離DNA，應提供相應的緩沖體系核酸分離純化多糖的去除：多糖水解酶蛋白質的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑（SDS、異硫氰酸胍等）蛋白酶處理多酚的去除：加入還原劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG，可防止酚類與DNA的結合鹽離子

7、的去除：70的乙醇洗滌多糖的去除：蛋白質的去除：多酚的去除：預冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)核酸沉淀 若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解 pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解預冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀核酸沉淀 若長期儲存建議使用TDNA質量檢測紫外分光光度計檢測法嘌呤和嘧啶的母環(huán)含有共軛雙鍵，因此也有紫外吸收現(xiàn)象，且在260nm和280nm處也存在吸收峰。蛋白質中含苯環(huán)的氨基酸在這兩個波長下也會發(fā)生光吸收。因此，通過260nm和280nm下樣品的吸收值比率可判斷核酸純度DNA質量檢測紫外分光光度計檢測法嘌呤和嘧啶的母

8、環(huán)含有共軛A：測DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260mOD230應大于2.0。1) OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2) 小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；3) OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。 測定結果分析A：測DNA： 測定結果分析瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物

9、的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNADNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色

10、，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，D根據(jù)OD260定量：測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/mlb. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/mlc. oligonucleotide = 33 mg/ml根據(jù)OD260定量：植物生物工程實驗二(植物DNA的提取)課件PCR實驗原理聚合酶鏈式反應(

11、polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。在待擴增的DNA片斷兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。PCR實驗原理聚合酶鏈式反應(polymerase chaiDNA復制（replication）起始 解旋 引物酶結合延伸連接終止解鏈方向3353535353353DNA復制（replication）起始 解旋 引物酶結植物生物工程實驗二(植物DNA的提取)課件植物生物工程實驗二(植物DNA的提取)課件溫度（）時間（min）94726094變性（1min

12、）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR 反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數(shù)是94變性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數(shù)量滿足實驗需求為止。溫度（）時間（min）9494變性（1min）60 退一般PCR反應條件一般PCR反應條件儀器藥品1.5ml離心管；5ml離心管；研磨棒；5ml吸頭；1000ul吸頭（盒）；200ul吸頭（盒）；10ul吸頭（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30u

13、l移液器；2ul移液器；試劑瓶；量筒恒溫水浴鍋；高速離心機；紫外分光光度計；電泳儀；電泳槽；酸度計；電子天平；PCR儀CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；瓊脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB儀器藥品1.5ml離心管；5ml離心管；研磨棒；5ml吸頭；實驗步驟試劑配制貯存液最終含量100mlTris（121.14）1 M12.114g1M Tris HCl, pH 8.0先用蒸餾水溶解加至90ml左右，再用HCl調整pH至8.0，定容至100ml貯存液最終含量100mlEDTA（292.25）0.5 M14.613g0.5M EDTA, pH 8

14、.0先用蒸餾水，再加入NaOH（固體）調pH至8.0，定容至100ml貯存液最終含量100mlNaCl（58.44）5 M29.22g蒸餾水定容至100ml5M NaCl實驗步驟試劑配制貯存液最終含量100mlTris（121.1貯存液最終含量100mlCTAB2%2g5M NaCl1.4M28ml0.5M EDTA20mM4ml1M Tris HCl pH8.0100mM10mlPVP1%1g蒸餾水定容至100ml2CTAB貯存液最終含量（10ml）3mlCTAB1g0.3g5M NaCl1.4ml0.42ml蒸餾水8.6ml2.58ml10% CTAB貯存液最終含量100mlCTAB2%2

15、g5M NaCl1.4貯存液最終含量100ml1M Tris HCl, pH 8.010 mM10 ml0.5 M EDTA, pH 8.01 mM2 ml蒸餾水定容至1000 mlT10E1貯存液最終含量（1000ml）100mlTris54g5.4gH3BO427.5g2.75g0.5 M EDTA, pH 8.020ml2 ml蒸餾水定容至100 ml5TBE貯存液最終含量100ml1M Tris HCl, pH 8.異丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB貯存液最終含量（100ml）4.2ml異戊醇4ml168ul氯仿96ml4032ul抽提液1M Tris HCl；0.5

16、M EDTA；5M NaCl；T10E1以及所有需使用的離心管，各種吸頭均需滅菌異丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB貯存液最操作流程操作規(guī)程1.稱取100mg新鮮葉片，置于預冷1.5ml離心管中，加入液氮，研為細粉。加入350l新鮮2CTAB緩沖液，再仔細研磨。（CTAB用于抽提DNA）2.用350l新鮮2CTAB緩沖液，沖洗研磨棒，加入2l巰基乙醇，混勻。65水浴45分鐘，每15分鐘搖動一次。冷卻至室溫，靜置2分鐘。3.每支離心管加入700l氯仿：異戊醇（24：1）（672氯仿:28異戊醇）混合液。輕柔短暫地混和，避免DNA斷裂。顛倒幾次。（氯仿、異戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白質

17、）4.在微型離心機中，以14，000rpm離心5分鐘。移取上層水層，置于新的、標識好的1.5ml離心管中。注意避免取到中層物質。將氯仿：異戊醇廢液倒入廢液缸。5.加入50l 10CTAB（溶于0.7M NaCl），輕柔混和，并保證混和完全。操作流程操作規(guī)程6.重復第3、第4步。7.每支離心管中加入等體積異丙醇（400500l）。上下顛倒幾次，4靜置20分鐘（或20，15分鐘）。（異丙醇用于沉淀DNA）8.14，000rpm離心20分鐘。小心倒出上清夜，避免DNA顆粒丟失。倒置離心管，空氣干燥（12分鐘）。9.用1ml70乙醇清洗DNA（3分鐘），14,000rpm離心30分鐘。小心倒出70%乙

18、醇，用1ml 90乙醇清洗DNA，14,000rpm離心30分鐘，小心地倒去乙醇。倒置離心管，空氣中干燥，或用真空泵干燥15分鐘。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10.以150l T10E1或蒸餾水溶解DNA，加入12l不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37反應1小時。11.4保存（20長期保存）。6.重復第3、第4步。冷卻至室 溫2l-巰基乙醇100mg鮮葉水 浴1.5ml離心管液 N2研 磨700l CTAB65，45離 心/15加入700l氯仿：異戊醇（672:28）靜置2min渦旋混和，加入50 l 10CTAB溫和短時514,000 rpm上清夜短時溫和輕柔混和

19、加入等體積異 丙 醇循環(huán)一次離心靜置304，20沉淀離心14,000 rpm20空氣干燥121 ml 70乙醇沉淀314,000 rpm沉淀加入150l T10E11 ml 90乙醇離心14,000 rpm30空氣干燥12l RNAseA37，1h-20保存-20，15冷卻至室 溫冷卻至2l100mg鮮葉水 浴1.5ml離心管液 N2研瓊脂糖凝膠電泳取5TBE緩沖液20mL加水至100mL，配制成1TBE稀釋緩沖液，待用。 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL 1TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為1瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖

20、動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。瓊脂糖凝膠電泳取5TBE緩沖液20mL加水至100mL，配3. 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內加入1TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。 3. 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩

21、端分別用橡皮膏緊密封住。將加樣：取10L DNA樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。

22、 加樣：取10L DNA樣品與2L 6上樣液混勻，用微量紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉入分光光度計的石英比色杯中。b分光光度計先用一定量的水校正零點。c測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d計算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù) 50/1000；e分析純度。紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a吸取一定量的DNA樣PCR反應體系成分體積DNA模板1 ug前向引物(10 uM)1 ul后向引物(10 uM)1 ulMaster Mix (Taq酶+緩沖液+染料)12.5 ulddH2O補至25ulPCR反應體系成分體積DNA模板0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。