高二生物16課時(shí)學(xué)完選修1半年卡人教版講陸巍巍第14講pcr二

1、PCR（二）一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧一、PCR條件小結(jié)PCR:即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,二、PCR實(shí)驗(yàn)流程PCR), 是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù),它能以極少量的DNA為模板,在幾小時(shí)內(nèi)出上百萬份的DNA拷貝。一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧PCR 一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧變性：當(dāng)溫度上升到 90以上時(shí)，雙鏈DNA 解聚為單鏈。復(fù)性：溫度下降到 50左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈 DNA 結(jié)合。延伸：溫度上升到 72左右，溶液中的四種脫氧

2、核苷酸在一個(gè)循環(huán)TaqDNA 聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則鏈。新的DNA1一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧一個(gè)問題：最少需要多少次循環(huán)，才能獲得DNA目的片段的完整拷貝？從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的 DNA 單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行 DNA 的延伸。這樣，DNA 聚合酶能特異地處于兩個(gè)引物之間的DNA 序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。2一、PCR條件小結(jié)1、PCR基本流程回顧一、PCR條件小結(jié)2、PCR所需條件

3、小結(jié)模板DNA：可以是DNA，也可以是RNA，當(dāng)用RNA作為模板時(shí)，需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA;DNA模板含量合適，可以減少PCR多次循環(huán)帶來的堿基錯(cuò)配。一、PCR條件小結(jié)2、PCR所需條件小結(jié)4種脫氧核苷酸：由四種dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP ）提供，每種的濃度應(yīng)相等。2、PCR所需條件小結(jié)引物：引物的長度過短會(huì)影響PCR的特異性，要求有16-30bp。引物過長使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度(72)，亦會(huì)影響產(chǎn)物的特異性。四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，不要有連續(xù)3個(gè)以上的相同嘌吟或嘧啶存在。 尤其是引物3端，不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或C，否則會(huì)使引物與核酸的G或C富集區(qū)錯(cuò)誤互補(bǔ)，從

4、而影響PCR的特異性。TaqDNA聚合酶：催化DNA子鏈，是熱穩(wěn)定性比較好的工具酶，但應(yīng)注意在-20保存。溫度控制：緩沖液、Mg2+：提供PCR反應(yīng)合適的酸堿度與某些離子， Taq酶的活性需要Mg2+。3【例1】在 PCR 反應(yīng)中，只有一個(gè) DN【例2】PCR 一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物I 延伸而成的 DNA 單鏈作模板段作為模板，經(jīng)過一次循環(huán)后，含引物的 DNA 單鏈占 DNA總鏈數(shù)的（）時(shí)將（）A1/2B1/4C1/8D1仍與引物 I 結(jié)合進(jìn)行 DNA 子鏈的延伸與引物 II 結(jié)合進(jìn)行 DNA 子鏈的延伸同時(shí)與引物 I 和引物 II

5、 結(jié)合進(jìn)行子鏈延伸D無需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭子鏈【例3】利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的【例3】利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA類似（如延伸的基礎(chǔ)，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA類似（如延伸的基礎(chǔ)圖所示）圖中引物為單鏈 DN圖所示）圖中引物為單鏈 DN段，它是子鏈段，它是子鏈下列有關(guān) PCR 過程的敘述中，正確的是（下列有關(guān) PCR 過程的敘述中，正確的是（）A PCR 是一項(xiàng)在生物體外技術(shù)特定的完整DNA 分子的核酸B C DPCR 過程中只需要兩個(gè)引物分子Taq 酶的作用是將單個(gè)的脫氧核苷酸連接到雙鏈DN段上在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條核苷酸鏈等長的DN段4【例4】圖表示利用 P

6、CR 技術(shù)擴(kuò)增目的【例4】圖表示利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA（類似下列敘述錯(cuò)誤的是DNA（類似下列敘述錯(cuò)誤的是）從理論上推測，第二輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A 的 DN3/4在第二輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)則不能擴(kuò)增目的耐熱的 DNA 聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到 3端段占【例4】二、PCR實(shí)驗(yàn)流程1、實(shí)驗(yàn)操作5二、PCR實(shí)驗(yàn)流程1、實(shí)驗(yàn)操作在 PCR 實(shí)驗(yàn)中，需要用到微量離心管，它是一種薄壁二、PCR實(shí)驗(yàn)流程1、實(shí)驗(yàn)操作管、總體積為 0.5mL。具體操作時(shí)，用微量移液管，按照一定

7、的配微量離心管中依次加入各組分。二、PCR實(shí)驗(yàn)流程1、實(shí)驗(yàn)操作 再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì) PCR 儀的循環(huán)程序即可。二、PCR實(shí)驗(yàn)流程2、注意事項(xiàng)為避免外源 DNA 等的污染，PCR 實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。PCR 所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。使用前5二、PCR實(shí)驗(yàn)流程二、PCR實(shí)驗(yàn)流程2、注意事項(xiàng)在微量離心管中添加反應(yīng)成分是，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。2、注意事項(xiàng)所有的成分都加入后，離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約

8、 10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。二、PCR實(shí)驗(yàn)流程3、結(jié)果分析DNA 在 260nm 的紫外線波段有一這一特點(diǎn)進(jìn)行 DNA 含量的測定。二、PCR實(shí)驗(yàn)流程3、結(jié)果分析DNA 在 260nm 的紫外線波段有一這一特點(diǎn)進(jìn)行 DNA 含量的測定。吸收峰，可以利用吸收峰，可以利用7二、PCR實(shí)驗(yàn)流程3、結(jié)果分析具體方法如下：將樣品進(jìn)行 50 倍稀釋：取2L反應(yīng)液至98L蒸餾水中以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長 260nm 處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零；加入步驟 1 中的 DNA 稀釋液 100L 至比色杯中，測定 260nm 處的光吸收值；根據(jù)下面的公式計(jì)算 DNA

9、含量：DNA 含量（g/mL）=50*(260nm 的讀數(shù))稀釋倍數(shù)二、PCR實(shí)驗(yàn)流程3、結(jié)果分析紫外分光光度計(jì)三、PCR的應(yīng)用三、PCR的應(yīng)用拓展1：DNA技術(shù)：PCR能以極少量的DNA為模板,在幾小時(shí)內(nèi) DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難于對(duì)樣品出上百萬份的由于DNA中四種堿基排列順序千變?nèi)f化，使DNA具有多樣性，而DNA的多樣性使得每個(gè)細(xì)胞中的DNA具有特異性，因此DNA也可以像用于甄別一樣用來識(shí)別，這種方法就是DNA技術(shù)。進(jìn)行分析研究（如DNA方面。其它：檢測,被廣泛地應(yīng)用于遺傳疾病的、刑偵破案技術(shù)）、古生物學(xué)、克隆和DNA序列測定等各嫌疑人：可以在現(xiàn)場留下的

10、中提取DNA（從現(xiàn)場獲得的一滴血液、一根毛發(fā)、中細(xì)胞里提取DNA），酶切后電泳獲得DNA圖譜，再和嫌疑人的DNA圖譜突變、定性定量檢測進(jìn)行對(duì)照比較，如果完全一樣或高度一致。基本就能斷定這些就是嫌疑人，從而用于偵破。8三、PCR的應(yīng)用三、PCR的應(yīng)用拓展2：DNA分子雜交技術(shù)：拓展1：DNA技術(shù)：在含目的的DN段上用放射性同位素（或熒光分子）標(biāo)記，以此作為探針，使探針與組DNA雜交，若顯示出雜交帶，就表明樣品中含有目的。甄別嫌疑人親子鑒定三、PCR的應(yīng)用拓展2：DNA分子雜交技術(shù)：【例5】PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外特定的DN是（段的核酸）技術(shù)，如圖表示過程下列說法錯(cuò)誤的在含目的

11、的DN段上用放射性同位素（或熒光分子）標(biāo)記，組DNA雜交，若顯示出雜交帶，就表以此作為探針，使探針與明樣品中含有目的。9【例5】PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外【例6】下列關(guān)于 PCR 技術(shù)應(yīng)用的敘述，不正確的是特定的DNA片段的核酸）技術(shù)，如圖表示過程下列說法錯(cuò)誤的是（ A B生物 C D）檢測患者血液中胰島素的含量A B加 C甲過程高溫使 DNA 變性解旋，該過程不需要解旋酶的作用丙過程用到的酶在高溫下失活，因此在PCR 擴(kuò)增時(shí)需要再添在同一反應(yīng)體系里加入多對(duì)特異性引物以同時(shí)檢測多種病原微檢測患者的血液中的含量發(fā)生突變的位點(diǎn)進(jìn)行檢測如果把模板 DNA 的兩條鏈用15N 標(biāo)記，游

12、離的脫氧核苷酸不對(duì)編碼凝血因子的做標(biāo)記，循環(huán) 3 次后，在形成的子代 DNA 中含有15N 標(biāo)記的 DNA占 25%D PCR 中由堿基錯(cuò)配引起的變異屬于突變【例8】（多選）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）在法醫(yī)學(xué)中得到普遍應(yīng)用，主要【例10】（2011 江蘇）請回答工程方面的有關(guān)問題：是因?yàn)樵摷夹g(shù)（）（1）利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的，其原理與細(xì)胞內(nèi) DNA類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈 DN。段，它是子鏈延伸的基礎(chǔ)A靈敏度高 B需要的目標(biāo)DNA 量少 C反應(yīng)時(shí)間短D不需要特定序列的引物10【例10】（2011 江蘇）請回答【例10】（2）設(shè)計(jì)引物是 PCR 技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。工程方面的有關(guān)問題：從理論上推測，