水稻轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)方法與步驟

1、水稻轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)操作方法步驟一、水稻愈傷組織的誘導(dǎo)（一）以水稻幼胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織消毒：取水稻未成熟種子（灌漿期），按以下步驟消毒：1）用自來(lái)水沖洗種子，去掉浮起的癟谷；2）將種子放入250ml無(wú)菌燒杯中（種子數(shù)量約占1/3體積），用200ml 70%酒精消毒2分鐘；（在操凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸鈉（NaClO）溶液，同時(shí)加數(shù)滴吐溫-20，浸泡90分鐘；4）倒去NaClO溶液，用無(wú)菌蒸餾水清洗種子4-5遍。誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無(wú)菌操作）1）用鑷子夾住種子，在無(wú)菌濾紙上用鋼鉤擠出幼胚，置入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；2）操作完畢后封好培養(yǎng)皿（一般保鮮膜），在暗處適溫下（

2、25-28C ）培養(yǎng)5天；3）繼代培養(yǎng)。用鑷子剝下胚性愈傷組織（去掉芽及膜狀物），置入繼代培養(yǎng)基中（凸 起面向上），暗處適溫下（25-28C）培養(yǎng)3天。（二）以水稻成熟胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織消毒：取水稻成熟種子，人工或者機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無(wú)菌斑的種子，按以下步驟消毒:1）將適量種子放入10ml離心管中（100顆左右），倒入75%酒精消毒2分鐘；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分鐘；3）倒去次氯酸鈉溶液，用無(wú)菌蒸餾水清洗種子5-6遍，最后一遍浸泡30分鐘。誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無(wú)菌操作）1）種子放在無(wú)菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿12-14顆；2）操作完畢

3、用封口膜（Micropore TMSurgical Tape）封好培養(yǎng)皿，在28C光照培養(yǎng)箱， 暗培養(yǎng)培養(yǎng)3周；3）在超凈工作臺(tái)上打開(kāi)培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織（淡黃色，致密 呈球狀，去除種子和芽），置入繼代培養(yǎng)基中，在28 C光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周（2周愈傷組織更為松散）。（如不馬上用，需轉(zhuǎn)移至暗處，于22C繼續(xù)培養(yǎng)1周）二、農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液100W于4ml YEP （含50mg/lKan和50mg/l Str）培養(yǎng)液中，28C, 250rpm振蕩培養(yǎng)20-36h至菌液OD600為0.8-1.0 （顏色接 近橙黃色）。三、共培養(yǎng)和抗性愈傷組織

4、的選擇感菌與共培養(yǎng)：1）取培養(yǎng)好的菌液500山于1.5ml離心管中，4C, 4000rmp，離心2min,去上清。用 含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD600的終濃度為0.01（0.08-0.1 ）；2）將長(zhǎng)到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5分鐘；3）將愈傷組織取出，置于無(wú)菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；4）將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上。25C暗培養(yǎng)2-3天（表面會(huì)長(zhǎng)有薄薄的一層農(nóng)桿菌）。選擇：1）將愈傷組織取出，用無(wú)菌水清洗5-6次（多次洗會(huì)更好），其間需不停的振蕩。再 用含250mg/l羧芐青霉素鈉的無(wú)菌水清洗12遍。最后置于無(wú)菌濾紙上瀝干

5、2小 時(shí)；2）將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含250mg/lCarbenicillin （羧芐青霉素鈉）和50mg/l潮霉素 的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇，28C，光照培養(yǎng)14天（若農(nóng)桿菌無(wú)法抑制，可加 大抗生素濃度，最大用過(guò)500mg/l）；3）將長(zhǎng)有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到含250mg/l Carbenicillin和50mg/l潮霉素的培 養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇，28C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長(zhǎng)出。四、抗性愈傷組織的預(yù)分化（可選）將新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中，25C，光照培養(yǎng)7天。五、抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根挑取從同一愈傷來(lái)的顏色鮮黃的抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)

6、皿或塑料 廣口瓶中（每皿或每瓶放置5-7顆），用封口膜封好，放入恒溫培養(yǎng)室中，28C，光照培養(yǎng) （16h光/8h暗），等待分化成苗（15-30天）。待苗長(zhǎng)至1cm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗 注：以上一至五的操作步驟皆在無(wú)菌條件下進(jìn)行。六、轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽轉(zhuǎn)基因苗從分化到移栽最短時(shí)間為兩個(gè)月左右。將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑 出（苗長(zhǎng)至試管頂部，就要及時(shí)開(kāi)蓋），打開(kāi)封口膜，加入適量蒸餾水或無(wú)菌水（防止培養(yǎng) 基長(zhǎng)菌），煉苗3天至一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長(zhǎng)，檢測(cè)。附錄：各種母液及培養(yǎng)基的配制方法一、溶液配制0.1%升汞：小心稱取1克HgCl，用少量蒸餾水溶解后，定容至1

7、000ml。25%次氯酸鈉溶液：量取250mlNaClO，用蒸餾水定容至1000ml。激素溶液配制方法：激素溶解方法母液濃度KT加少量稀堿（1M NaOH）溶解，再用蒸餾水定容1 mg/ml6-BA加稀堿（同上）或鹽酸溶解，再用蒸餾水定容1 mg/mlNAA加堿溶解（1M NaOH），再用蒸餾水定容1 mg/ml2，4-D加少量稀堿或酒精溶解，再用蒸餾水定容1 mg/mlABA先用乙醇溶解，再用蒸餾水定容1 mg/ml水稻培養(yǎng)液配方（貯備液）：試劑每10升溶液中的克數(shù)1. nh4no39142. NaH2PO4-2H2O4033. K2SO47144. CaCl28865. MgSO47H2O

8、32406. MnCl2-4H2O15.0(N%) 6-M7O24-4H2O0.74H3BO39.34分別溶解后加500mlZnSO47H2O0.35濃硫酸，然后再加蒸CuSO45H2O0.31餾水到10L。FeCl36H2O77.0檸檬酸（-水合物）119*使用時(shí)，每4L培養(yǎng)液中加1號(hào)6號(hào)貯備液，各5ml。為使水稻生長(zhǎng)健壯，可另加SiO 50ppm100ppm。調(diào)節(jié)pH值至5.05.1。、培養(yǎng)基的配制:1.培養(yǎng)基母液配方:1) N6培養(yǎng)基母液(20倍)：每升含：KNO356.6gMgSO4-7H2O2.7gKH2PO48g(NHD2SO49.26gCaCl- 2H2O3.32g2) B5微量

9、母液(100倍)：每升含：KI0.0750gH3BO30.30gMnSO4-H2O1.0gZnSO4-7H2O0.2gNa2MoO4-2H2O0.025gCuSO4-5H2O0.0025gCoCl2-6H2O0.0025g3) B5有機(jī)母液：煙酸(VB3)1mg/ml鹽酸毗哆醇(VB6)1mg/ml鹽酸硫胺素(VB1)10 mg/ml肌醇10 mg/ml4) MS培養(yǎng)基大量元素(20倍)：每升含:NH4NO333.0gKNO338.0gCaCl2.2H2O8.8 g(相 當(dāng)于 CaCl26.644g)MgSO4-7H2O7.4gKH2PO43.4g5）鐵鹽（100倍）：FeSO4-7H2O2.

10、78gNa2EDTA2H2O3.73 g注：FeSO4-7H2O和Na2EDTA-2H2O分別溶解混合后，需加熱煮沸使Fe2借合，最終溶液顏色為深黃色。7） AA大量兀素母液（每升含量）：KCl2.95 gCaCl2-2H2O0.15gMgSO4-7H2O0.25gNaH2PO4-2H2O0.15g2.培養(yǎng)基配方1）粳稻幼胚、成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 g(2.8g)CH :0.3g2,4-D :2.5ml(2ml)蔗糖：

11、30gAgar8gPH值：5. 8注：括號(hào)中為成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份及用量，其它與幼胚配方相同。以下同2）粳稻幼胚、成熟胚愈傷組織繼代培養(yǎng)基（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 g(2.8g)CH :0.3g6-BA (2,4-D)0.5ml(2ml)NAA（不加）0.5ml蔗糖30gAgar8gPH值：5. 83）秈稻幼胚、成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（每升含量）：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10mlMS大量兀素：煙酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1

12、ml鹽酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g2,4-D :2.5ml麥芽糖：30gPhytagel:4.0 gPH值：5. 84）粳（秈）稻共培養(yǎng)培養(yǎng)基（每升含量）：N6 （MS）大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇:1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：2 gMES3.9g蔗糖（麥芽糖）： 30gCH :0.5gPhytagel:4.0gPH值：5. 555C時(shí)加As至終濃度為200 uM5）選擇培養(yǎng)基（MCH/NCH，秈稻/粳稻）每升含量：MS/N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml

13、煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇:1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g2,4-D :2ml麥芽糖/蔗糖：30gPhytagel:4.0gPH值：5. 8天菌后再加：Carbenicillin250mg/l第一輪選擇：Hyg （潮霉素）50 mg/LCarbenicillin250mg/l第二輪選擇：Hyg （潮霉素）50 mg/L6）粳稻預(yù)分化培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5

14、gCH :0.3g6-BA:2 mlNAA0.1 mlABA5 ml蔗糖：30gPhtagel4.0gPH值5.8天菌后再加Carbenicillin250mg/l7）粳稻分化培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g6-BA:3 mlNAA0.5 ml蔗糖：30gAgar8 gPH值：5. 88）粳稻生根培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量兀素：25mlB5微量：5ml鐵鹽：5ml煙 酸：0.5ml鹽酸毗哆醇：0.5 ml鹽酸硫胺素：

15、0.5 ml肌 醇：5ml蔗 糖：20gagar:7 g9）秈稻分化培養(yǎng)基配方（每升含量）：MS大量兀素：50mlB5微量：10ml鐵鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸毗哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3gKT:2.5 mlNAA0.5 ml麥芽糖：30gagar:8 gPH值:5. 8Hyg （潮霉素）50 mg/L10）農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的YEP液體培養(yǎng)基配方（每升含量）：酵母提取物10g蛋白胨10gNaCl5gpH7.0鏈霉素（Str）50mg卡那霉素（Kan）或其它抗生素50mg11）農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的YM固體培養(yǎng)基配方（每升含量）：KH