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文檔簡介

1、兩大方法幫你搞定質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學研究中最常用的實驗技術(shù)。原理 依賴于限制性核酸內(nèi)切酶,DNA連接酶和其他修飾酶的作 用,分別對目的基因和載體 DNA 進行適當切割和修飾后, 將二者連接在一起,再導入宿主細胞,實現(xiàn)目的基因在宿主 細胞內(nèi)的正確表達。質(zhì)粒構(gòu)建方式多樣,常規(guī)的 T4 連接酶,以及最近更受歡迎 的重組酶方式。下面小編就總結(jié)一下 T4 連接酶與重組酶構(gòu) 建質(zhì)粒方法,通過比較,其最大的不同點可能在于目的基因 的設計以及連接體系。壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 連接酶,可以催化粘端或平 端雙鏈 DNA 或 RNA 的 5-P 末端和 3-OH 末端之間以 磷

2、酸二酯鍵結(jié)合,該催化反應需 ATP 作為輔助因子。質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切,一 般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個,盡量使載體的末 端具有特異性,防止自連。冋選酶切體系VECTOR3 ugCutSmart Buffer5 ul 限制性內(nèi)切酶 11 ul限制性內(nèi)切酶21 ul酶切體系一般選擇50ul,試劑加好之后37C孵育68小 時,或適當延長時間,保證質(zhì)粒酶切完全。每隔一段時間振 蕩一下并離心以防液滴蒸發(fā)至管蓋上。酶切后載體通過切膠 回收線性化載體。根據(jù)目的序列構(gòu)建引物后,引物設計原則簡單總結(jié)一下: (1)前向引物:5 端-保護堿基序列+限制性內(nèi)切酶 1 酶切 位點序列

3、+基因正向引物序列 -3 端(2)反向引物:5 端-保護堿基序列+限制性內(nèi)切酶 2 酶切 位點序列+基因反向引物序列 -3 端 如果目的基因片段較長的話,可以選擇 PCR 方式擴增目的 基因片段冋選 PCR 擴增體系ddH20 :14ul10 xTaq buffer :2ul10um DNTP : 1ul10um primer F : 0.5ul10um primer R : 0.5ul 模 板 DNA : 1ulTaq 酶:1ul冋選 PCR 擴增條件(1)95C:5min(2) 35cycle95C:30s55C: 30s (退火溫度可以根據(jù)目的引物TM值決定,一般退火溫度根 據(jù)引物 TM

4、 值降低 5度) 72C: 40s(3)72C:10min(4)16C:hold引物擴增之后,首先要進行瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小, 然后通過膠回收,獲得純化目的片段產(chǎn)物.由于加入保護堿基, 回收產(chǎn)物需要進行雙酶切,雙酶切方法與質(zhì)粒酶切方法相同。載體與目的基因的連接,推薦在1020pl反應體系中進 行接反應。25 ng 25 ng 退火 TOC o 1-5 h z 產(chǎn)物2 ul10 x T4 buffer1 ulT4 DNA ligase1 ulT4 連接酶一般選擇 4 度過夜轉(zhuǎn)化 過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中(一般為DH5a )將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中(一般為DH5a ),涂板,培養(yǎng)挑取單

5、克隆,并鑒定 挑去平板上的單克隆培養(yǎng),可以通過 PCR 或者酶切初步鑒 定陽性克隆,對初步鑒定出來的陽性克隆進行測序。下面開始重點介紹重組酶構(gòu)建質(zhì)粒,基于同源基因重組原理, 適用于向幾乎任何載體在任何位點進行定向克隆,無需考慮 插入片段自身攜帶的酶切位點可高效克隆50 bp10 kb片 段,同時構(gòu)建時間也大大縮短。載體的制備一般推薦雙酶切線性化,線性化完全,假陽性 克隆低。酶切體系同上。對于使用重組方式連接來說, PCR 要設計引物, 設計引 物時要根據(jù)質(zhì)粒載體和基因序列選擇合適的同源序列,通過 PCR 擴增方式進行連接, PCR 的產(chǎn)物要純化。 引物設計原則簡單總結(jié)一下:(1)前向引物:5

6、端-上游克隆載體末端同源序列+基因正向擴增引物-3 端 (2)反向引物:3 端-基因反向擴增引物+下游克隆載體末 端同源序列-5 端 如果設計的基因特異插入片段擴增產(chǎn)物長度較長,可以選擇PCR 方式進行目的引物的擴增。冋選PCR冋選PCR擴增體系ddH2014ul10 x Taq buffer2 ul10 um DNTPul10 x Taq buffer2 ul10 um DNTP1 ul10 um primer F0.5 ulVector0.5 ul10 um primer R1 ul10 um primer F0.5 ulVector0.5 ul10 um primer R1 ulTaq

7、酶1 ul冋選 PCR 擴增條件(1)95C:5min(2) 35cycle95C:30s55C: 30s (退火溫度可以根據(jù)目的引物TM值決定,一般退火溫度根 據(jù)引物 TM 值降低5度) 72C: 40s(3)72C:10min(4)16C:holdPCR 擴增后,通過膠回收方式獲得純化的 PCR 產(chǎn)物。純 化后的 PCR 產(chǎn)物不需要進行酶切,直接用于重組反應。3. 目的引物與線性載體進行重組反應??蛇x重組體系5 x CE II Buffer4 pl線性化克隆載體50 200 ng插入片段擴增產(chǎn)物20 200 ngExnase? II2 pl在冰水浴中配制,配制完成后,用移液器上下輕輕吹打幾

8、次 混勻各組分,置于37 C反應30 min。待反應完成后,立 即將反應管置于冰水浴中冷卻5 min。重組效率在反應30 min 左右達到最高,反應時間不足或者太長都將會降低克隆 效率,這樣大大減少了連接時間。轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中(一般為DH5a ),涂板,培養(yǎng) 過夜。挑取單克隆,并鑒定 挑去平板上的單克隆培養(yǎng),可以通過 PCR 或者酶切初步鑒 定陽性克隆,對初步鑒定出來的陽性克隆進行測序。 最后,幾個主要注意事項:載體克隆位點選擇盡量選擇無重復序列,且 GC 含量比 較均勻的區(qū)域進行克隆。當克隆位點上下游 20 bp 區(qū)域內(nèi)GC含量均在40% - 60%范圍之內(nèi)時,克隆效率將達到 最大.最適克隆載體與插入片段摩爾比為 1:2,即最適插入片段 使用量為0.06 pmol。這些摩爾數(shù)對應的DNA質(zhì)量可由以 下公式粗略計算獲得:最適克隆載體使用量二0.02 x克隆載體堿基對數(shù)ng (0.03 pmol)最適插入片段使用量 = 0.04 x 插入片段堿基對數(shù) ng(0.06 pmol)雙酶切 1 和 2,在設置酶切體系時要考慮酶切溫度以及 Activity

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