酶非水相催化PPT

1、關(guān)于酶非水相催化第一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月觀念的改變有關(guān)酶的催化理論是基于酶在水溶液中的催化反應建立起來的。近年來，進行了非水介質(zhì)的酶結(jié)構(gòu)與功能、酶作用機制、酶作用動力學的研究，建立起非水酶學（non-aqueous enzymology)。第二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月對于大多數(shù)有機化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應的發(fā)生。 1984年，克利巴諾夫（Klibanov）等人在有機介質(zhì)中進行了酶催化反應的研究，并成功地在有機介質(zhì)中利用酶的催化作用，獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機化合物，指出酶可以在水

2、與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應。非水酶學第三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 酶非水相催化的主要內(nèi)容受非水介質(zhì)的影響，其催化特性與在水相中不同酶的非水相催化類型主要包括:一、有機介質(zhì)的酶催化；二、氣相介質(zhì)的酶催化；三、超臨界流體介質(zhì)中的酶催化；四、離子液介質(zhì)中的酶催化go第四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月有機介質(zhì)中的酶催化指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應;適用范圍:底物、產(chǎn)物兩者或其一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用;原因:酶在有機相中能保持結(jié)構(gòu)的完整;特性:酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性、熱穩(wěn)定性等有所改變；應用：多肽、酯類、甾體轉(zhuǎn)化、功

3、能高分子合成、手性藥物拆分的研究。第五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月氣相介質(zhì)中的酶催化指酶在氣相介質(zhì)中進行催化反應；適用范圍：底物是氣體或能轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)；特性：氣體介質(zhì)密度低，擴散容易；與在水相中明顯不同；第六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月超臨界流體介質(zhì)中的酶催化酶在超臨界流體中進行催化反應；超臨界流體指溫度和壓力超過臨界點的流體；supercritical狀態(tài)，簡稱SC 狀態(tài)； 由于黏度、介電常數(shù)、擴散系數(shù)和溶解能力都與密度有關(guān)，因此可以方便地通過調(diào)節(jié)壓力來控制超臨界流體的物理化學性質(zhì)。要求：超臨界流體對酶結(jié)構(gòu)無破壞；具良好化學穩(wěn)定性；溫度不可太高太低；壓力不可太

4、高；易獲得等。第七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：1)與水相比較，脂溶性反應物和產(chǎn)物可溶于超臨界CO中，而酶作為蛋白質(zhì)不溶解，有利于三者的分離；2)產(chǎn)品回收時，不需要處理大量的稀水溶液，可解決環(huán)境污染問題；3)與有機溶劑體系相比，CO無毒，不燃燒、廉價、無有機溶劑殘留之虞；4)CO超臨界體系具有氣體的高擴散系數(shù)、低粘度和低表面張力使底物向酶的傳質(zhì)速度加快從而使反應速度提高，且在臨界點附近，溶解能力和介電常數(shù)對溫度和壓力敏感，故反應速度提高。亦可以控制反應速率和反應平衡；5)可簡化產(chǎn)物的分離，有可能將反應和分離過程耦合。已對10多種酶反應進行了研究，主要是酯化反應、酯交換反應、酯

5、水解反應和氧化反應。反應條件溫和，反應溫度低于50Back第八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月離子液介質(zhì)中的酶催化指酶在離子液中進行催化作用；離子液Ionic liquids (ILs)是有機陽離子與有機（無機）陰離子在室溫下呈液態(tài)低熔點鹽類，揮發(fā)性低，穩(wěn)定性好；特性：酶在其中有良好的穩(wěn)定性、區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性。第九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié)有機介質(zhì)中水和有機溶劑對酶催化反應的影響go第十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、微水介質(zhì)體系；2、與水溶性有機溶劑組成的均一體系；3、與水不溶性有機溶劑組成的兩相或多相體系；4、（正）膠束體系；5

6、、反膠束體系。一、有機介質(zhì)反應體系第十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、微水介質(zhì)體系是有機溶劑和微量水組成的反應體系;微量水主要是酶分子結(jié)合水,對維持酶分子空間構(gòu)象和催化活性至關(guān)重要;另一部分水分配在有機溶劑中;酶以凍干粉或固定化酶的形式懸浮于有機介質(zhì)中;是常見的有機反應體系.第十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2、與水溶性有機溶劑組成的均一體系由水與極性較大的有機溶劑互混組成；水與有機劑含量均較大；適用的酶較少；辣根過氧化酶（HRP）應用：催化酚類或芳香胺類聚合成聚酚或聚胺類物，在環(huán)保黏合劑、導電聚物、發(fā)光聚合物材料中有重要作用。第十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2

7、022年6月3、與水不溶性有機溶劑組成的兩相或多相體系由水和疏水性較強的有機溶劑組成兩相或多相體系；游離酶、親水性底物溶于水相，疏水性底物或產(chǎn)物溶于有機相；固定化酶在界面；催化反應在兩相界面進行；適于底物或產(chǎn)物屬于疏水化合物的反應。第十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月4、（正）膠束體系大量水溶液中含少量與水不溶的有機溶劑，加入表面活性劑形成水包油微小液滴；表面活性劑極性端朝外,非極性端朝內(nèi),有機溶劑包在液滴內(nèi)部;酶在水溶液中,疏水底物或產(chǎn)物在膠束內(nèi),反應在膠束界面進行.水相有機相酶第十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月5、反相膠束體系反相膠束: 在與水不互溶的在量有機溶劑

8、中,加入表面活性劑后形成的油包水的微小水滴；1997年首次報道酶在反相膠束中具有活性(已發(fā)現(xiàn)40多種酶)；酶分子處在反膠束內(nèi)，穩(wěn)定性好；反膠束與生物膜有相似之處，適于研究生物膜表面酶的結(jié)構(gòu)、催化特性、動力學特性。水相有機相酶第十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、水對有機介質(zhì)中酶催化的影響水在酶催化反應中發(fā)揮著雙重作用:一方面,水分子直接或間接地通過氫鍵疏水鍵及范德華力等非共價鍵相互作用來維持酶的催化活性所必需的構(gòu)象,與酶分子緊密結(jié)合的一層左右的水分子對酶的催化活性是至關(guān)重要的,稱之為必需水,不同酶與必需水結(jié)合的緊密程度及所結(jié)合的必需水數(shù)量是不同的;第十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作

9、于2022年6月水的影響另一方面水是導致酶的熱失活的重要因素,有水存在時隨著溫度的升高酶分子會發(fā)生以下變化而失活:(1)形成不規(guī)則結(jié)構(gòu);(2)二硫鍵受到破壞;(3)天冬酰胺和谷氨酰胺水解變?yōu)橄鄳奶於彼岷凸劝彼?(4)天冬氨酸肽鍵發(fā)生水解.因此在非水相酶反應體系中存在著最佳含水量,該最佳含水量不僅取決于酶的種類也與所選用的有機溶劑有關(guān).第十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、水對酶分子空間構(gòu)象的影響無水下酶空間構(gòu)象被破壞,故需一層水化層;必需水:維持酶分子完整空間構(gòu)象所必需的最低水量;不同的酶所需求的必需水的量差別較大;每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶卻需3.5

10、102個水分子原因:必需水是維持酶分子結(jié)構(gòu)中氫鍵、鹽鍵等副鍵所必需的。第十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2.水對酶催化反應速度的影響 典型的非水酶體系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距會導致酶催化活力的較大改變。水影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性、活性位點的極性和穩(wěn)定性。第二十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月有機介質(zhì)中含兩類水：結(jié)合水、游離水；在結(jié)合水不變的條件下，體系含水量的變化對酶催化活性影響不大；然而在一些體系中，溶劑和底物性質(zhì)對酶活力也有直接或間接影響；為了排除溶劑對最適含水量的影響，Halling建議用水活度（aw

11、）描述有機介質(zhì)中酶催化活力與水的關(guān)系：水活度：體系中水的逸度與純水逸度之比；用體系中水蒸汽壓與相同條件下純水蒸汽壓之比表示； Aw=P/Po P：一定條件下體系中水的蒸汽壓 Po:相同條件下純水的蒸汽壓水活度與溶劑極性大小無關(guān)，最適含水量與溶劑極性成正比，故采用水活度作參數(shù)更確切；3.水活度（activity of water)第二十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月有機溶劑主要通過以下三種途徑發(fā)生作用:一是有機溶劑與酶直接發(fā)生作用通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象從而導致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有機溶劑和能擴散的底物或反應產(chǎn)物相互作用影響正常反應的進行;三是有機溶劑還可以直接

12、和酶分子周圍的水相互作用三 有機溶劑對有機介質(zhì)中酶催化的影響第二十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 有機溶劑對酶結(jié)構(gòu)與功能的影響在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，較好地保持其構(gòu)象；有機溶劑中酶分子不能直接溶解，因此根據(jù)酶分子特性與有機溶劑特性不同，其空間結(jié)構(gòu)的保持也有不同。有些酶在有機溶劑作用下，其結(jié)構(gòu)受到破壞；有的酶分子則保持完整；第二十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）有機溶劑對酶分子表面結(jié)構(gòu)的影響：由于酶分子與溶劑的直接接觸，酶分子表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；（2）有機溶劑對酶活性中心結(jié)合位點的影響：通過減少整個活性中心的數(shù)量，溶劑對酶的活性中心產(chǎn)生影響，活性中

13、心數(shù)目喪失的多少取決于溶劑中的疏水性大小。Why？溶劑與底物競爭酶的活性中心結(jié)合位點，溶劑為非極性，影響更明顯，溶劑分子能滲透入酶的活性中心，降低活性中心的極性，增加酶與底物的靜電斥力。第二十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）有機溶劑對結(jié)合水的影響一些相對親水性的有機溶劑能夠奪取酶表面的必需水而導致酶失活。酶失水的情況與溶劑的介電常數(shù)和疏水性參數(shù)有關(guān)。由于酶與溶劑競爭水分子，體系的最適含水量與酶的用量及底物濃度有關(guān)。2. 有機溶劑對酶活性的影響第二十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）溶劑屬性(極性)與酶活力的定量關(guān)系酶在不同的有機溶劑中活力差別很大；研究最多的是

14、酶活力與溶劑極性參數(shù)lgP之間的關(guān)系；P：指溶劑在正辛烷與水兩相中的分配系數(shù)，lgP越大，極性越小；Laane 的實驗發(fā)現(xiàn)：lgP4，酶具有較高活力，此類溶劑較理想 。2lgP4，酶活力中等。第二十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月、有機溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響溶劑能直接或間接地與底物和產(chǎn)物相互作用。溶劑能改變酶分子必需水層中底物或產(chǎn)物的濃度。有機溶劑極性小，疏水性強，疏水性底物難于進入必需水層；有機溶劑極性過強，親水性強，疏水性底物在有機溶劑中溶解度太低；故選擇2lgp5的有機溶劑作為有機介質(zhì)為宜。第二十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 酶在有機介質(zhì)中的催化特性

15、有機溶劑的存在,改變了疏水相互作用的精細平衡,從而影響到酶的結(jié)合部位.有機溶劑會改變底物存在狀態(tài).結(jié)果影響酶的穩(wěn)定性和酶的底物特異性,立體選擇性,區(qū)域選擇性和化學鍵選擇性.第二十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一、底物專一性有機介質(zhì)中酶活性中心結(jié)合部位與底物的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變,致使酶的底物特異性發(fā)生改變;水溶液中底物與酶活性中心結(jié)合靠疏水作用;有機介質(zhì)中有機劑與底物的疏水作用更強;N-乙酰-L絲氨酸乙酯N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水性: 介質(zhì)水辛烷蛋白酶水解速度底物第三十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月底物專一性(續(xù))不同的有機介質(zhì)，酶的底物專一性也不一樣；極性較強的有機

16、溶劑中,疏水性較強的底物易反應;極性較弱的有機溶劑中,疏水性較弱的底物易反應;N-乙酰-L絲氨酸乙酯N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水性: 二氯甲烷吡啶枯草桿菌蛋白酶+丙醇(極性較強)底物介質(zhì)反應速度第三十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、對映體選擇性（enantioselectivity)又稱立體選擇性或立體異構(gòu)專一性，是酶在對稱的外消旋化合物中識別一種異構(gòu)體的能力大小的指標；立體選擇系數(shù)越大，酶催化的對映體選擇性越強立體選擇系數(shù)：第三十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月有機溶劑中酶對底物的對映體選擇性由于介質(zhì)的親(疏)水性的變化而發(fā)生改變。酶在水溶液中立體選擇性強，疏水

17、性強的有機溶劑中的酶的立體選擇性差。這種選擇性是由底物的兩種對映體把水分子從酶分子疏水結(jié)合位置換出來的能力不同；介質(zhì)的疏水性加大，L型底物置換水的過程在熱力學上不利。原因第三十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月溶劑的幾何形狀也影響酶的對映體選擇性，如Ottolina報道一些脂肪酶、蛋白酶在（R）-香芹酮及（S）-香芹酮中立體選擇性不同；對映體選擇性意義：蛋白酶在水溶液中對L-氨基酸起作用，而在有機介質(zhì)中可用D-氨基酸為底物合成手性藥物，有重要應用。第三十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月三、區(qū)域選擇性（regioselectivity） 酶能夠選擇性地催化底物分子中某個區(qū)域

18、的基團優(yōu)先發(fā)生反應；用區(qū)域選擇系數(shù)Krs的大小衡量。與立體選擇系數(shù)相似，用1、2代替構(gòu)型；反應的位置選擇因子： K1，2=（kcat/Km)1/ （kcat/Km)2例：1,4-二丁?；?2-辛基苯丁醇脂肪酶轉(zhuǎn)脂反應+甲苯乙腈K4，120.5第三十五張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月四、鍵選擇性（chemoselectivity)即同一個底物分子中有2種以上化學鍵可與酶反應，酶對其一優(yōu)先反應；6-氨基-1-己醇黑曲霉脂肪酶毛霉脂肪酶羥基?；被；純?yōu)意義：可在不需基團保護下合成氨基醇脂；第三十六張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月五、 熱力學穩(wěn)定性有機溶劑中酶的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)

19、定性都比水溶液中高；有機溶劑中酶的熱穩(wěn)定性還與介質(zhì)中水含量有關(guān)；原因：可能是有機介質(zhì)中缺少引起酶變性的水分子；Klibanov和Volkin認為：由于有機溶劑中缺少使酶熱失活的水分子，由水引起的蛋白質(zhì)熱失活的全過程難以進行。第三十七張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月六.pH值特性有機溶劑中的酶能夠“記憶”在冷凍干燥或丙酮沉淀前所在緩沖液中的PH，pH記憶，pH印記;現(xiàn)象：脂肪酶催化三丁酸甘油與正庚醇的轉(zhuǎn)酯反應，酶的反應速度與其冷凍干燥前水溶液的的PH密切相關(guān)，反應的最適PH接近于水溶液中的最適PH原因：在有機溶劑中酶分子表面的必需水只要在特定的PH和離子強度下，酶分子活性中心周圍的基因

20、才能處于最佳的離子化狀態(tài)檢測：根據(jù)緩沖液中磷原子的核磁共振譜的變化核利用分子探針技術(shù)，可以檢測酶從緩沖液中冷凍干燥或有機溶劑沉淀后，轉(zhuǎn)入吸水有機溶劑中的PH第三十八張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月在有機介質(zhì)中酶所處的pH環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體上之前所使用的緩沖液pH值相同，稱為pH-imprinting;當酶分子從水溶液轉(zhuǎn)移到有機介質(zhì)時，原有的解離狀態(tài)不變，被保持在有機介質(zhì)中；有機介質(zhì)中酶催化反應的最適ph通常與在水溶液的pH接近；但有些有機溶劑中酶的最PH與水溶液中相差較大，還與緩沖液種類和離子強度有關(guān);可用有機相緩沖液(疏水性酸與對應鹽或疏水性堿與對應鹽）控制酶的解離狀態(tài)，消

21、除酶pH印記特性的影響；第三十九張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 有機介質(zhì)中酶催化反應的條件及其控制酶在有機介質(zhì)中的催化反應受各種因素影響，主要應控制的條件有:酶的種類和濃度底物的種類和濃度有機溶劑的種類水含量溫度pH離子強度第四十張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一、有機介質(zhì)中酶催化反應的類型1、合成反應2、轉(zhuǎn)移反應3、醇解反應4、氨解反應5、異構(gòu)反應6、氧化還原反應7、裂合反應go第四十一張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、合成反應有機介質(zhì)中水含量極微，可催化水解反應的逆反應；（1）脂肪酶或酯酶催化有機酸和醇進行酯的合成反應：2）蛋白酶可在有機介質(zhì)中催化氨基酸進行合成反應，生成多肽第四十二張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2、轉(zhuǎn)移反應如脂肪酶催化酯與有機酸反應生成另一種酯與有機酸,即轉(zhuǎn)酯反應：back第四十三張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3、醇解反應假單胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸單酯化合物back第四十四張，PPT共五十七頁，創(chuàng)作于2022年6月4、氨解反應如脂肪酶催化酯類進行不對稱氨解反應：R-