液質聯(lián)用知識

1、前言:如何利用LC-MS/MS,更快更好的建立生物樣品分析 方法？前言:以前曾在實驗室的seminar上，做過一次關于如何建立生物樣品分析方法的工作報告。時隔兩年，恰逢儀器信息網(wǎng)舉辦第一屆網(wǎng)絡原創(chuàng)作品大獎賽，在這里將這幾年來對于生物樣品分析的一點點感受總結一下，與大家交流、分享。首先明確一下文中提到的“生物基質”，主要指的是血漿、血清、唾液、尿液或者器官組織等。 藥物透過機體的各種生理屏障，進入到這些基質中，就是我們所說的生物樣品” （Biosample）。生物樣品中的藥物濃度極低，我們如何利用靈敏度高的儀器如LC-MS/MS， 更好的建立測定生物樣品中藥物濃度的分析方法呢？下面我主要從以下四

2、個方面進行闡述:一、色譜-質譜條件的確立1、質譜條件的確立當使用液質聯(lián)用儀對某一個化合物進行定量分析時，我們就需要建立一個質譜分析方法。雖 然儀器的型號不盡相同，但原理卻是一致的，基本原理如圖所示。我們在確定方法時，主要 考慮以下幾個因素：（1）化合物的性質:包括化合物的結構、化合物的極性及化合物的pKa值。首先了解化合 物的結構，我們可以大概的推斷其碎片離子的斷裂方式，選擇較為穩(wěn)定的碎片離子作為定量 反應的子離子，也可以根據(jù)經驗判斷選用哪種source更為合適；根據(jù)化合物的極性大小， 我們可以選擇一種或幾種恰當?shù)娜軇┳鳛槿苊剑饶鼙ＷC完全將樣品溶解，又能提高化合物 的質譜響應；而清楚化合物的

3、pKa值，有助于我們選擇流動相的添加劑及其pH值，從而提高質譜響應。（2）流動相添加劑的選擇:在液相紫外檢測中，我們使用的添加劑的種類繁多，可以是揮 發(fā)性的酸或者堿（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易揮發(fā)的緩沖鹽（如磷酸二氫鈉- 磷酸緩沖液、磷酸二氫鉀-磷酸緩沖鹽）。但是在液質分析中，基于質譜檢測的原理，我們 只能使用可揮發(fā)的酸堿或緩沖鹽，那么種類就會受到極大的限制。在日常分析中使用到的添 加劑主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸銨、乙酸銨等緩沖鹽，見圖一。三乙胺在紫 外檢測中，常作為掃尾劑，但是在液質檢測中是絕對禁止的。因為三乙胺進入質譜后不易清 除，殘留及其嚴重，能夠抑制離子的響應。一

4、旦三乙胺用量增加，時間延長，那么慢慢地質譜就不能靈敏的檢測化合物了，所以這點大家要注意，尤其對于液質的初期使用者。圖一液質分析中推薦使用的流動相和添加劑推薦使用不推薦使用，盡乾不使用存機潛劑jz+n：乙席.二氧甲焜 正札叫t 瓠化曜甲部、乙神、昇丙醉、己靛葦，環(huán)己焜.H雌沖波乙般楨、甲瀏S酸碗莢他乙酸.甲酸.:#，乙憤正尚r ）埔酸，商氯酸.嬉酸、借酸.橫彼 季胺-做碰、三匕肢掐潔制、表面沃牲削沮j-對軾劑、dick*aiHR2CG8.3）質譜離子源的選擇:質譜出現(xiàn)早期，主要有電子轟擊源（EI）、化學電離源（CI）、電 噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源（APCI）。但隨著科學技術的進步，

5、源的發(fā)展也是 日新月異。目前，用于定量的離子源主要是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源（APCI），他們的使用范圍如圖二所示。圖二12341010101010MALDIa LG -4*cc oCLGCGCLC MALDIVolatilityESI源是液相離子化，主要用于分析極性比較大的化合物及大分子化合物；而APCI源是氣 相離子化，主要用于分析極性較小的小分子化合物。在掌握以上基本信息后，根據(jù)各個型號儀器的標準操作規(guī)程(SOP)進行操作，對各個參 數(shù)進行優(yōu)化，從而確定質譜分析方法。2、色譜條件的建立在液相色譜紫外檢測中，要求化合物之間的分離必須達到完全分離，即R1.5，如果進行 定量，

6、那R最好沱2.0，這就給分析工作者提出了很高的要求一一準確的配制流動相，精確 的調好流動相的pH及添加劑的濃度。但在液質分析中，我們經常使用多反應監(jiān)測(MRM/SRM)對化合物進行定量，由于MRM要求選擇兩次離子，因此它具有很高的專屬 性，基于這點我們對多個化合物同時進行檢測時，不需要彼此間達到完全分離就可以對他們 進行定量分析。但這里需要強調的一點是，由于生物樣品中含有大量的基質，這些基質的存 在會嚴重的干擾和影響化合物的測定，因而我們需要利用色譜將化合物與基質分開，從而降 低基質效應的影響，即降低離子抑制。二、內標的選擇檢測時使用內標物的目的是消除操作誤差，因此我們在進行生物樣品分析時必須

7、選擇一個合 適的化合物作為內標物。LC/MS/MS法的高專屬性使其對內標物與待測物的色譜分離要求 不高，但要求內標物色譜行為及提取回收率，尤其是質譜信號響應與待測物的接近；要求在 測定過程中內標物受系統(tǒng)誤差及碰撞壓力變化的影響與待測物一致。所以理想的內標物應為 待測組分的同位素標記物，但由于同位素標記物價格非常昂貴且不易獲得，我們嘗試選用結 構相似的化合物（或者同系物）作為內標物。三、樣品預處理方法的選擇根據(jù)前人的經驗，我們在生物樣品預處理中，經常使用到的方法主要有以下三種一一沉淀蛋 白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE），而這三種方法的選擇，主要取 決于化合物的特性。分析

8、極性比較大的化合物，優(yōu)先考慮使用沉淀蛋白法，這種方法操作簡單，省時省力；缺點 是生物基質中內源性物質去除的不徹底，基質效應較大，使得方法靈敏度不高。分析極性較小的化合物，我們可以選擇液液萃取法，這種方法根據(jù)相似相溶的原則進行分離 提取，優(yōu)點在于處理完的樣品較干凈，內源性物質去除徹底；缺點在于消耗有機試劑的量很 大，對操作人員、環(huán)境的污染也大。固相萃取法，在國外使用尤為廣泛。它采用固相萃取小柱作（見圖三）為分離媒介，小柱中 添加了不同填料的固定相，如以鍵合硅膠為基質的如C18、NH2、COOH、PSA、SAX等， 是硅膠的表面活性大為降低，最大程度的降低了極性化合物的不可吸附和拖尾，使樣品回收 率和重現(xiàn)性得到保障；以高分子聚合物為基質的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高純 度、高比表面的特點；以吸附型填料為固定相的如硅酸鎂、氧化鋁等，主要通過表面的極性 吸附達到分離