生物化學(xué)專業(yè)知識公開課一等獎優(yōu)質(zhì)課大賽微課獲獎?wù)n件

1、11 RNA生物合成11.1 模板和酶11.2 以DNA為模板合成RNA過程11.3 以 RNA 為模板合成 RNA 過程11.4 RNA轉(zhuǎn)錄后加工第1頁11.1 模板和酶11.1.1 轉(zhuǎn)錄模板11.1.2 RNA聚合酶11.1.3 模板與酶識別結(jié)合第2頁轉(zhuǎn)錄（transcription） 所謂 轉(zhuǎn)錄 是以 DNA 為模板合成 RNA 過程。 DNA 是經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，將遺傳信息轉(zhuǎn)移到 RNA 分子上。 第3頁DNA大小與基因 生物體 DNA 分子大小并不等于基因總和，尤其是高等真核生物，DNA 分子上非編碼區(qū)遠(yuǎn)比編碼區(qū)長得多。 而真正為蛋白質(zhì) （酶）編碼基因僅僅占 DNA 分子一小部分。 不編碼基

2、因而是一些不被轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，它們含有主宰基因轉(zhuǎn)錄和表示功效，是基因不可缺乏部分。 第4頁 編碼一個或幾個蛋白質(zhì)全部氨基酸核苷酸次序，稱為基因（gene）和基因組。 通常也把這些編碼蛋白質(zhì)基因片段稱為結(jié)構(gòu)基因。 在 DNA 分子上還有些片段是為 rRNA 和 tRNA 編碼核苷酸，這些片段有時也稱為基因。 第5頁重復(fù)基因： DNA 中有些基因是重復(fù)，稱為重復(fù)基因。 原核生物中重復(fù)基因數(shù)較少，真核生物中重復(fù)基因則很豐富。 如 核蛋白體 rRNA 基因數(shù)，酵母細(xì)胞內(nèi)為140 個，而果蠅則達(dá)數(shù)千個。又如酵母 tRNA 基因：為每一個不一樣 tRNA 編碼基因平均達(dá) 10 個重復(fù)基因。這種多重復(fù)基因現(xiàn)象，

3、是為適應(yīng)細(xì)胞分裂和增殖需要。 第6頁基因重合 ： 在一些病毒中存在基因重合現(xiàn)象。 A 基因BCDEJFGHK第7頁不連續(xù)基因： 真核生物許多基因是不連續(xù)，即：一個完整基因被一個或更多個插入片段所間隔。 這些插入片段可有幾百乃至上千個堿基對，它們不編碼任何蛋白質(zhì)分子或成熟 RNA。內(nèi)含子： 把這些插入而不編碼序列稱為內(nèi)含子（intron）。外顯子：把被間隔編碼蛋白質(zhì)基因部分稱為外顯子。第8頁 DNA 轉(zhuǎn)錄只轉(zhuǎn)錄基因部分其中包含內(nèi)含子和外顯子部分。 因而轉(zhuǎn)錄出來全部 RNA 都必須經(jīng)過加工，除去其中內(nèi)含子 并經(jīng)復(fù)雜修飾 才能成為成熟各種 RNA，其中 mRNA 才能成為合成蛋白質(zhì)模板。第9頁11.

4、1.1 轉(zhuǎn)錄模板基因中雙鏈 DNA 中僅有一股鏈被轉(zhuǎn)錄。把被轉(zhuǎn)錄一股鏈稱為模板鏈（template strand），另一股鏈稱為編碼鏈（coding strand）。 mRNA與模板鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)。mRNA 核苷酸次序則與編碼鏈完全相同，只是其中以 U 代替了 T。所以，mRNA 遺傳信息與編碼鏈相同，代表了基因編碼次序。第10頁第11頁11.1.2 RNA聚合酶11.1.2.1 原核生物RNA聚合酶11.1.2.2 真核生物RNA聚合酶第12頁RNA 聚合酶 RNA聚合酶催化底物合成時是形成 磷酸二酯鍵。合成方向是53：即 RNA 聚合酶 是沿著模板鏈 3 5 方向移動。RNA 聚合酶條件： （1

5、）模板，雙鏈 DNA 或單鏈 DNA 均可作模板。 （2）活化底物，需要 4 種三磷酸核苷酸： ATP， GTP、 UTP 及 CTP 為反應(yīng)底物。 （3）二價金屬離子，主要是 Mg2+ 和 Mn2+ 。 第13頁RNA 聚合酶含有兩個核苷酸結(jié)合位點(diǎn)：起始部位：結(jié)合 ATP 或 GTP 。所以被轉(zhuǎn)錄 DNA 第一個堿基通常是TTP（胸腺嘧啶）。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制不一樣，不需要引物，因而合成 RNA 第一個核苷酸經(jīng)常是 pppA 或 pppG。延伸部位：結(jié)合下一個堿基。第14頁第15頁11.1.2.1 原核生物RNA聚合酶大腸桿菌 RNA 聚合酶（ 450KD ）它由 4 種亞基組成。整個酶亞基組成是2

6、，稱為 全酶 。沒有亞基 RNA 聚合酶稱為關(guān)鍵酶。全酶 作用是識別起始，而關(guān)鍵酶作用是延長及識別轉(zhuǎn)錄終止。第16頁各亞基作用：亞基：決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄。亞基：與轉(zhuǎn)錄過程相關(guān)（催化）。亞基：結(jié)合DNA模板（開鏈）。亞基： 識別起始點(diǎn)，參加解開 DNA 雙鏈，找到模板鏈。第17頁11.1.2.2 真核生物RNA聚合酶 在真核生物中則有三種類型 RNA 聚合酶。RNA 聚合酶: 定位核仁，轉(zhuǎn)錄18S，5.8S 和 28S RNA。RNA 聚合酶: 定位核原生質(zhì)，轉(zhuǎn)錄 mRNA 前體和 hnRNA 。RNA 聚合酶 : 定位核原生質(zhì)，轉(zhuǎn)錄 tRNA 和 5S RNA。第18頁11.1.3 模板與酶識

7、別結(jié)合轉(zhuǎn)錄是不連續(xù)、分區(qū)段進(jìn)行。每一轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個轉(zhuǎn)錄單位，包含若干個結(jié)構(gòu)基因及其上游（upstream）調(diào)控序列。RNA聚合酶結(jié)合到調(diào)控序列中被稱為開啟子（promoter）特異DNA序列上，指導(dǎo)附近DNA片段（gene）轉(zhuǎn)錄。 第19頁 開啟子（promoter）：轉(zhuǎn)錄起始時， RNA 聚合酶結(jié)合在被轉(zhuǎn)錄 DNA 區(qū)段上，結(jié)合特定部位稱為開啟子。它是 20 至 200 個堿基特定次序。 通常將 DNA（編碼鏈）上被轉(zhuǎn)錄第一個堿基以十1 代表；第二個為 十2 。十1 之前堿基為 -1 ，第二個為-2，。開啟子位置在被轉(zhuǎn)錄堿基之前所以次序號均為負(fù)。習(xí)慣上也將 +1 以下轉(zhuǎn)錄方向稱“下游”，

8、-1 以上稱“上游”，開啟子在上游區(qū)。 第20頁原核生物開啟子： 原核生物開啟子次序中存在兩個共同次序，即 -10 次序，也稱為 Pribnow 次序（pribnow box）和 -35次序。-10 次序：-10 次序右末端離 RNA 轉(zhuǎn)錄第一個堿基約 5 到 10 個堿基。-10 基本次序是TATAATG。-10 次序被看作是雙螺旋打開形成開放開啟復(fù)合物區(qū)域。- 35 次序：經(jīng)典情況下含有 9 個堿基，被認(rèn)為是酶結(jié)合起始部位。第21頁RNA pol對與 -35區(qū)識別結(jié)合后，酶向下游移動，抵達(dá)Pribnow盒，酶已跨入了轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，形成相對穩(wěn)定酶DNA復(fù)合物，就能夠開始轉(zhuǎn)錄。第22頁在-25

9、區(qū)有TATA盒，又稱為Hogness盒，基本上都由A、T堿基所組成，其功效與聚合酶定位相關(guān)，DNA雙鏈在此解開并決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在-75區(qū)有CAAT盒，其一致序列為GGTCAATCT，CAAT盒與轉(zhuǎn)錄起始頻率相關(guān)。除開啟子外，真核生物基因組中還有一個稱為增強(qiáng)子（enhancer）序列，它能極大地促進(jìn)開啟子轉(zhuǎn)錄活性。真核生物開啟子第23頁增強(qiáng)子作用特點(diǎn)： 能在很遠(yuǎn)距離（大于幾kbp）對開啟子產(chǎn)生影響； 不論位于開啟子上游或下游都能發(fā)揮作用； 其功效與序列取向無關(guān)； 無生物種屬特異性； 受發(fā)育和分化影響。第24頁11.2 以DNA為模板合成RNA過程11.2.1 轉(zhuǎn)錄起始11.2.2 轉(zhuǎn)錄延長1

10、1.2.3 轉(zhuǎn)錄終止第25頁11.2.1 轉(zhuǎn)錄起始11.2.1.1 原核生物轉(zhuǎn)錄起始 11.2.1.2 真核生物轉(zhuǎn)錄起始第26頁11.2.1.1 原核生物轉(zhuǎn)錄起始當(dāng) RNA 聚合酶亞基發(fā)覺其識別位點(diǎn)時，全酶就與開啟子-35區(qū)序列（TTGACA）結(jié)合形成一個封閉開啟子復(fù)合物。在這一區(qū)段，酶與模板結(jié)合很松弛，酶隨即移向-10區(qū)TATAAT序列并跨入了轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。第一個磷酸二酯鍵生成后，因子從全酶解離下來，關(guān)鍵酶在 DNA 鏈上向下游滑動，關(guān)鍵酶連同生成二核苷酸，繼續(xù)結(jié)合于DNA模板上并沿 DNA 鏈前移，進(jìn)入延長階段。第27頁11.2.1.2真核生物轉(zhuǎn)錄起始真核生物也需要RNA聚合酶對起始區(qū)上游D

11、NA序列進(jìn)行識別和結(jié)合，生成起始復(fù)合物。上游DNA序列，統(tǒng)稱為順式作用元件。能直接或間接識別、結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為反式作用因子。轉(zhuǎn)錄因子：往往還需要各種蛋白因子幫助，這些蛋白因子統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子，它們與RNA聚合酶形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參加轉(zhuǎn)錄起始過程。第28頁11.2.2 轉(zhuǎn)錄延長 轉(zhuǎn)錄延長化學(xué)反應(yīng)，在原核生物和真核生物之間沒有太多區(qū)分，只是催化RNA聚合酶不一樣。轉(zhuǎn)錄延長在轉(zhuǎn)錄鼓泡上進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄鼓泡是一個含有 關(guān)鍵酶 、DNA 和 新生 RNA 區(qū)域，在這個區(qū)域里含有一段解鏈 DNA “泡”。在轉(zhuǎn)錄鼓泡里，雜交鏈中 RNA 3-羥基對進(jìn)來核糖核苷三磷酸能進(jìn)行結(jié)合合成反應(yīng)，使鏈

12、不停延長。DNA 雙鏈中約有17個 bp 被解開。延長速率大約是每秒鐘 50 個核苷酸，轉(zhuǎn)錄鼓泡移動 170nm 距離。在“泡”里新合成 RNA 與模板 DNA 鏈形成一雜交雙螺旋。此段雙螺旋長約 12bp。第29頁 RNA-DNA雜交鏈長度： 在 RNA 聚合酶沿著 DNA 模板移動整個過程中形成 RNA-DNA 雜交鏈長度及 DNA 未解開區(qū)域長度均保持不變。 這表明：在 RNA 聚合酶后面 DNA 重新卷成螺旋速率和前面被酶解開速率是一樣。 第30頁轉(zhuǎn)錄錯誤頻率： RNA 聚合酶沒有核酸外切酶活性，不能對進(jìn)入RNA 鏈核苷酸進(jìn)行校正，所以轉(zhuǎn)錄錯誤頻率是每 104 或 105 中有一個錯誤

13、，是 DNA 復(fù)制中錯誤 105 倍。這種準(zhǔn)確性雖很低，但因?yàn)?RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很多，極少數(shù)有缺點(diǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大約不會產(chǎn)生有害影響。第31頁在電子顯微鏡下觀察原核生物轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，可看到像羽毛狀圖形。說明在同一DNA模板上，有多個轉(zhuǎn)錄同時在進(jìn)行。在RNA鏈上觀察到小黑點(diǎn)是多聚核糖體（polyribosome），即一條mRNA鏈連上多個核糖體，可見轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已在進(jìn)行。真核生物有核膜把轉(zhuǎn)錄和翻譯隔成不一樣細(xì)胞內(nèi)區(qū)間，所以沒有這種現(xiàn)象。第32頁11.2.3 轉(zhuǎn)錄終止11.2.3.1原核生物轉(zhuǎn)錄終止11.2.3.2真核生物轉(zhuǎn)錄終止 第33頁11.2.3.1原核生物轉(zhuǎn)錄終止 RNA聚合酶碰到DNA中轉(zhuǎn)錄

14、終止信號終止子（terminator）時，RNA聚合酶不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來，就是轉(zhuǎn)錄終止。原核生物終止子顯著特點(diǎn) ： 轉(zhuǎn)錄終止次序特點(diǎn)其一是富含 GC，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物極易形成二重對稱性結(jié)構(gòu)；其二是緊接 GC 之后有一串A （大約6個）。所以，按此模板轉(zhuǎn)錄出來 RNA以幾個 U 殘基而結(jié)束，極易本身互補(bǔ)，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)可使聚合酶減慢移動或暫停RNA合成。依據(jù)是否需要蛋白質(zhì)因子參加，原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為依賴因子（rho）與非依賴rho因子兩大類。 第34頁第35頁11.2.3.2真核生物轉(zhuǎn)錄終止當(dāng)前，真核生物轉(zhuǎn)錄終止過程仍不清楚。試驗(yàn)表明，RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是在3

15、端切斷，然后腺苷酸化，并無終止作用。轉(zhuǎn)錄終止過程很可能與 RNA聚合酶I 和 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物末端連續(xù)U序列附近發(fā)夾結(jié)構(gòu)和富含GC正確區(qū)域相關(guān)。 第36頁11.3 以RNA為模板合成RNA過程在有些生物中，RNA能夠是遺傳信息基本攜帶者，并能經(jīng)過自我復(fù)制合成出與其本身相同分子。 第37頁11.4 RNA轉(zhuǎn)錄后加工11.4.1 mRNA 轉(zhuǎn)錄后加工11.4.2 tRNA 轉(zhuǎn)錄后加工11.4.3 rRNA 轉(zhuǎn)錄后加工11.4.4 核酶第38頁11.4.1 mRNA轉(zhuǎn)錄后加工（1）原核生物 mRNA 轉(zhuǎn)錄后加工（2）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工第39頁 （1）原核生物 mRNA 轉(zhuǎn)錄后加工 原核生物 mRNA

16、 通常不用修飾，因生成mRNA 高度不穩(wěn)定，當(dāng)它們 3 末端合成還未完成時，mRNA 5 末端已經(jīng)開始降解。就是說 mRNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時發(fā)生，mRNA 僅僅合成一部分時，翻譯就開始了。 第40頁（2）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工已知真核生物每種 mRNA 分子內(nèi)部含有數(shù)目改變很大內(nèi)含子。這些內(nèi)含子廣泛地分布于 mRNA 前體分子中，長短各不相同，但都比外顯子長。 真核生物 mRNA 前體物剪切加工，包含內(nèi)含子剪除及留下片段拼接成成熟 mRNA 等過程，稱為 RNA 剪接（RNA Splicing）。 剪接是在核內(nèi)進(jìn)行，而且是在加上“帽子”和接上“尾巴”之后。整個剪接過程完成之后，5 端“帽

17、子”和 3 端“尾巴”并不丟失。第41頁真核生物mRNA前體剪接 為二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)（transesterification）。在內(nèi)含子序列中有一個腺苷酸殘基，它2OH能夠?qū)?nèi)含子5 端與外顯子1連接磷酸二酯鍵做親電子攻擊，切開了外顯子1，使它3端游離出來，所以稱為轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。而腺苷酸原來已經(jīng)有3，5磷酸二酯鍵相連兩個相鄰核苷酸殘基，加上此2，5磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個由內(nèi)含子彎成套索樣結(jié)構(gòu)。已被切下外顯子13OH親電攻擊內(nèi)含子3末端與外顯子2之間3，5磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索形式被截下來，此時外顯子1和外顯子2能夠連接起來。第42頁第43頁11.4.2 tRNA轉(zhuǎn)錄后加工（

18、1）原核生物 tRNA轉(zhuǎn)錄后加工（2）真核生物 tRNA轉(zhuǎn)錄后加工第44頁 （1）原核生物 tRNA轉(zhuǎn)錄后加工 tRNA 成熟過程較為復(fù)雜，包含切割與核苷酸修飾。 多數(shù) tRNA 前體約比成熟分子大 20，在 5 和 3 端都含有多出次序。這些多出次序由特異核酸酶 RNase P 及 Rnase Q（或 RNase）分別在 5 和 3 端進(jìn)行切割 。第45頁 有些 tRNA 前體，在 3 端沒有 CCA 基，在成熟過程中需要加一個 CCA（結(jié)合氨基酸部位）。 有些 tRNA 基因轉(zhuǎn)錄前體很大，它包含兩個或更多由內(nèi)含子分隔 tRNA 次序。一樣也由核酸酶加工切割，除去內(nèi)含子部分修飾至一定大小。

19、全部 tRNA 分子中都含有百分率很高所謂“稀有堿基”，這些稀有堿基形成是在轉(zhuǎn)錄后與切割同時完成。堿基修飾是由酶催化如甲基化酶，該酶能將甲基引入 tRNA 核苷酸不一樣位置。其它更復(fù)雜修飾機(jī)理及酶正待研究。第46頁（2）真核生物 tRNA轉(zhuǎn)錄后加工核生物 tRNA 也是一個大轉(zhuǎn)錄物（tRNA前體轉(zhuǎn)錄物），這些轉(zhuǎn)錄物可能含有一個或多個 tRNA 次序。成熟 tRNA 也是在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切加工而成。第47頁 第48頁11.4.3 rRNA轉(zhuǎn)錄后加工（1） 原核生物 rRNA轉(zhuǎn)錄后加工（2）真核生物 rRNA轉(zhuǎn)錄后加工第49頁 （1） 原核生物 rRNA轉(zhuǎn)錄后加工 大腸桿菌核蛋白體 RNA（rRNA）是由三種核蛋白體 RNA 叢集在一起形成一個轉(zhuǎn)錄單位，彼此由間隙區(qū)（內(nèi)含子）分隔開來。 現(xiàn)在證實(shí)，在間隙區(qū)中還存在著 tRNA。這些 rRNA 和 tRNA 基因同時轉(zhuǎn)錄，形成一個長RNA 分子。在原核生物中，加工修飾與轉(zhuǎn)錄是同時進(jìn)行，所以在細(xì)胞內(nèi)從來不存在完整前體分子。 第50頁（2）真核生物 rRNA轉(zhuǎn)錄后加工 在經(jīng)典動物細(xì)胞核仁中有一段幾百個拷貝 DNA 次序（ 核糖體 DNA 或