內(nèi)障丸對(duì)抗精子抗體陽(yáng)性大鼠子宮一氧化氮合酶表達(dá)的影響

1、內(nèi)障丸對(duì)抗精子抗體陽(yáng)性大鼠子宮一氧化氮合酶表達(dá)的影響【摘要】目的討論內(nèi)障丸對(duì)抗精子抗體陽(yáng)性大鼠子宮一氧化氮合酶表達(dá)的影響。方法將istar雌性成年大鼠隨機(jī)分為6組。中藥低劑量組內(nèi)障丸、中藥高劑量組內(nèi)障丸、中藥對(duì)照組六味地黃丸、西藥對(duì)照組醋酸潑尼松片、模型組、空白組。從第1次免疫后1周開(kāi)場(chǎng)給藥，連續(xù)3周。之后檢測(cè)內(nèi)障丸對(duì)妊娠第3天大鼠子宮一氧化氮合酶表達(dá)的影響。結(jié)果內(nèi)障丸可明顯進(jìn)步大鼠交配后第3天子宮一氧化氮合酶表達(dá)，進(jìn)步大鼠的窩產(chǎn)仔鼠數(shù)。結(jié)論內(nèi)障丸能改善子宮內(nèi)環(huán)境，有利于受精卵著床。【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)障丸抗精子抗體一氧化氮合酶Keyrds：NeiZhangpills;Antisperantibdy;

2、iNS抗精子抗體AsAb陽(yáng)性不孕約占不孕患者的20%30%，具有較高的發(fā)病率。AsAb可以通過(guò)不同的環(huán)節(jié)影響生殖過(guò)程導(dǎo)致不孕和流產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察內(nèi)障丸對(duì)AsAb陽(yáng)性大鼠受孕后子宮一氧化氮合酶iNS的影響，討論內(nèi)障丸對(duì)子宮iNS的作用機(jī)制。為中藥治療AsAb陽(yáng)性流產(chǎn)及不孕提供理論根據(jù)。1材料與方法1.1材料內(nèi)障丸，6g/袋，黑龍江中醫(yī)藥附屬第一醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：031016。六味地黃丸，0.2g/丸，每丸相當(dāng)于原藥材3g，吉林濟(jì)邦藥業(yè)產(chǎn)品。醋酸潑尼松片5g/片，上海信誼藥業(yè)產(chǎn)品。硫酸慶大霉素8萬(wàn)u/只，批號(hào)031026，上海第一生化藥業(yè)公司產(chǎn)品。鼠抗人精子抗體酶免試劑盒由北京華美生物技術(shù)公

3、司提供，實(shí)驗(yàn)所需其它化學(xué)試劑耗材均由哈爾濱市醫(yī)藥公司化學(xué)試劑批發(fā)站提供。1.2方法用提取的膜抗原伴等體積弗氏完全佐劑，將二者充分研磨混勻，并參加硫酸慶大霉素10U/只。對(duì)除空白組外所有大鼠進(jìn)展雙側(cè)腹股溝處多點(diǎn)皮下注射，每只大鼠注射原量為0.4l，2周后用精子膜抗原加等體積不完全佐劑，對(duì)除空白組外所有大鼠進(jìn)展雙側(cè)腹股溝處多點(diǎn)皮下注射，進(jìn)展加強(qiáng)免疫每只大鼠注射抗原劑量同上次。1周后，用精子膜抗原再次雙側(cè)腹股溝處皮下多點(diǎn)注射?？瞻捉M大鼠于相應(yīng)時(shí)間于一樣位置多點(diǎn)注射等體積生理鹽水。將所有雌性大鼠隨機(jī)分為6組，每組12只。中藥低劑量組內(nèi)障丸9.72gkg-1d-1，中藥高劑量組內(nèi)障丸19.44gkg-1

4、d-1，中藥對(duì)照組六味地黃丸0.8gkg-1d-1，西藥對(duì)照組醋酸潑尼松片1.35gkg-1d-1，模型組、空白組等劑量蒸餾水，從第1次免疫后1周開(kāi)場(chǎng)給藥，連續(xù)3周。每組隨機(jī)取6只大鼠，于受孕第3天，處死大鼠。取子宮4%多聚甲醛過(guò)夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，正丁醇過(guò)夜，石臘包埋。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè).計(jì)量資料組間比擬方差分析，組間兩兩比擬采用t檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)，均采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包處理。2結(jié)果2.1藥物對(duì)交配后3d大鼠子宮iNS表達(dá)情況的影響測(cè)量采用半定量方法進(jìn)展，細(xì)胞漿被染成棕黃色定為陽(yáng)性結(jié)果，根據(jù)每張切片陽(yáng)性反響顆粒占細(xì)胞總數(shù)比例定為：陰性-：未見(jiàn)陽(yáng)性顆粒。弱陽(yáng)性+：陽(yáng)性顆粒少于

5、1/3。陽(yáng)性+：陽(yáng)性顆粒小于2/3且大于1/3。強(qiáng)陽(yáng)性+：陽(yáng)性顆粒大于2/3。為進(jìn)展定量統(tǒng)計(jì)描繪，分別對(duì)結(jié)果評(píng)分為-：1分；+：2分；+：3分；+：4分。每張切片計(jì)數(shù)3個(gè)視野，結(jié)果見(jiàn)表1。表1藥物對(duì)交配后3d大鼠子宮iNS表達(dá)情況的影響(略)由表1可見(jiàn)，模型組大鼠iNS表達(dá)低于空白組P0.01，高于醋酸潑尼松組P0.05，內(nèi)障丸可以進(jìn)步子宮iNS的表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)差異P0.05，六味地黃丸組iNS的表達(dá)明顯低于空白組P0.05。2.2藥物對(duì)大鼠窩產(chǎn)仔鼠數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。表2藥物對(duì)大鼠窩產(chǎn)仔鼠數(shù)的影響(略)由表2可見(jiàn)，模型組大鼠窩產(chǎn)仔鼠數(shù)明顯低于空白組，藥物組大鼠產(chǎn)仔鼠數(shù)有不同程度的進(jìn)步，

6、內(nèi)障丸低劑量組大鼠顯著高于模型組P0.01，六味地黃丸組窩產(chǎn)仔鼠數(shù)與模型組比無(wú)明顯差異P0.05，內(nèi)障丸高劑量組窩產(chǎn)仔鼠數(shù)與醋酸潑尼松組比無(wú)明顯差異P0.05，與空白組比無(wú)差異P0.05。3討論采用內(nèi)障丸治療AsAb陽(yáng)性不孕及流產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明內(nèi)障丸可以進(jìn)步大鼠子宮iNS表達(dá)，并進(jìn)步大鼠的窩產(chǎn)仔鼠數(shù)，提示內(nèi)障丸對(duì)AsAb陽(yáng)性不孕及流產(chǎn)有一定的預(yù)防和治療作用。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎為先天之本，元?dú)庵?，腎主藏精，精能化氣，腎精所化之氣，即為腎氣。腎精的盛衰，不僅關(guān)系到能否受孕，而且始終影響整個(gè)孕期。假設(shè)腎氣虧損，便不能固攝胎元而致流產(chǎn)。故腎虛是本病的主要原因，也是治療時(shí)需要解決的首要問(wèn)題。內(nèi)障丸是我院

7、自制中成藥，方中由海馬、鹿茸、熟地黃、枸杞子、山萸肉、人參等組成2。全方既補(bǔ)腎陰亦補(bǔ)腎陽(yáng)，使陽(yáng)生陰長(zhǎng)，陰陽(yáng)平衡，正如?景岳全書(shū)婦人規(guī)?指出：“善治陽(yáng)者，必于陰中求陽(yáng)，那么陽(yáng)得陰助而生化無(wú)窮；善治陰者，必于陽(yáng)中求陰，那么陰得陽(yáng)升而源泉不斷。從而使腎中精氣旺盛，陰陽(yáng)平衡，沖任調(diào)和以成胎孕。催化內(nèi)源性N生物合成的酶是一氧化氮合酶(NS),iNS是誘導(dǎo)型NS。N/NS系統(tǒng)參與女性生殖生理活動(dòng),如子宮內(nèi)膜周期性變化的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、卵泡發(fā)育3、卵巢性激素的分泌4、胚胎著床、維持妊娠5與分娩以及平滑肌的增殖分化等。其中以iNS在子宮內(nèi)膜的表達(dá)較顯著,功能也較重要6。N參與雌激素啟動(dòng)胚胎著床的信號(hào)通路7；N

8、合成阻滯可能導(dǎo)致胎盤血管形成障礙,從而引發(fā)胎盤淺表著床8。N在胎盤組織中可通過(guò)P9的活性參與胎盤構(gòu)造和功能調(diào)節(jié)9。本研究說(shuō)明模型組大鼠在妊娠第3天時(shí)子宮內(nèi)iNS表達(dá)比正常對(duì)照組明顯減少，偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，而正常對(duì)照組大鼠的子宮中那么有大量iNS分布，妊娠第3天正處于大鼠胚胎植入前，此時(shí)子宮正在為迎接胚胎做著積極的準(zhǔn)備，子宮中iNS的表達(dá)對(duì)此具有重要意義。iNS表達(dá)減少會(huì)引起N的產(chǎn)量降低，從而可能影響大鼠胚胎的發(fā)育和著床，導(dǎo)致妊娠失敗，這可能是AsAb陽(yáng)性大鼠生育才能下降的原因之一。中藥內(nèi)障丸可以明顯進(jìn)步子宮內(nèi)iNS的表達(dá)，醋酸潑尼松組iNS表達(dá)也較少，甚至找不到陽(yáng)性細(xì)胞。這可能因?yàn)榈厝姿煽梢酝ㄟ^(guò)

9、抑制iNSRNA的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)對(duì)iNS的抑制作用3，10，糖皮質(zhì)激素4還可以阻止細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)iNS的合成。所以本研究中醋酸潑尼松可能有抑制iNS的作用，導(dǎo)致iNS較少，從而對(duì)大鼠的生殖功能產(chǎn)生不利影響。圍著床期，子宮內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)適應(yīng)性變化，使胚泡的發(fā)育與子宮內(nèi)膜組織的分化同步，以利于著床。我們研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的iNS表達(dá)低于正常組，說(shuō)明AsAb陽(yáng)性大鼠胚胎著床期，子宮內(nèi)免疫環(huán)境紊亂，不利于孕卵著床，所以，模型組大鼠胚胎數(shù)較少，內(nèi)障丸高劑量組大鼠子宮iNS的表達(dá)情況與正常組相近，有利于孕卵著床，窩產(chǎn)仔鼠數(shù)也較理想。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定AsAb陽(yáng)性大鼠子宮iNS的表達(dá)及內(nèi)障丸對(duì)其的影響，討論iNS與

10、AsAb陽(yáng)性不孕及流產(chǎn)的關(guān)系，提示內(nèi)障丸可以進(jìn)步妊娠子宮iNS表達(dá)，進(jìn)而改善子宮內(nèi)環(huán)境，從而到達(dá)進(jìn)步生育才能、防止流產(chǎn)的治療目的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1賴安妮，宋濟(jì)范，劉仙菊,等.中藥胎寶抑制抗精子抗體的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，176：360.2陳惠錚，王素霞，王秀霞.中藥治療49例抗精子免疫性不孕癥J.中醫(yī)藥信息，2000，172：封3.3hatterjeeS，GangulaPRR，DngYL,etal.IunytheiallalizatinfnitrixidesynthaseIIIinreprdutivergansffeateratsduringtheestrusyleJ.His

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