發(fā)酵牛肉香腸肽的抗氧化穩(wěn)定性研究

1、PAGE PAGE - 11 -發(fā)酵牛肉香腸肽的抗氧化穩(wěn)定性研究近年來，隨著人們食品安全意識(shí)的提高，抗氧化肽因安全性高、易吸收、活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)引起了研究者的廣泛關(guān)注1-2。目前，已有部分抗氧化肽作為功能性食品和藥品實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)3-4?？寡趸挠傻鞍踪|(zhì)降解產(chǎn)生，在加工和貯藏過程中會(huì)發(fā)生水解、氧化、脫酰胺、環(huán)化等反應(yīng)，導(dǎo)致肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其生物活性5?？寡趸牡姆€(wěn)定性與溶液的酸堿性、溫度和鹽離子濃度等密切相關(guān)6-7，因此，對(duì)其在不同環(huán)境下穩(wěn)定性的研究極其重要。發(fā)酵肉制品是指在自然或人工控制的環(huán)境中，利用微生物或酶的作用使原料肉發(fā)生一系列復(fù)雜變化，形成具有良好的貯藏性和獨(dú)特風(fēng)味、色澤與質(zhì)

2、地的肉制品，其在生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈水解而產(chǎn)生具有生物活性的肽類物質(zhì)8。郭世良等9酶解得到發(fā)酵酸肉肽，并發(fā)現(xiàn)強(qiáng)酸強(qiáng)堿、高溫、高糖、高NaCl及銅、鋅離子不利于其抗氧化活性的保持。ZHU等10用鹽酸浸提得到金華火腿抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)其在酸性和中性條件下抗氧化活性較好，模擬胃腸消化會(huì)降低其活性。欒曉旭等5用磷酸浸提法從豬肉發(fā)酵香腸中提取到多肽，并發(fā)現(xiàn)在高溫和酸堿性環(huán)境中多肽活性喪失較快，糖類和NaCl會(huì)提高其自由基清除活性?？梢姡l(fā)酵肉制品中多肽抗氧化穩(wěn)定性的研究主要集中在發(fā)酵酸肉、腌制火腿和豬肉香腸上，而以牛肉為原料制作的發(fā)酵香腸研究較少；同時(shí)，香腸制作方式不同，多肽提取方法不同，其抗氧化穩(wěn)定

3、性也可能產(chǎn)生差異。因此，以牛肉為試材制備發(fā)酵香腸，并探究其多肽在不同環(huán)境的穩(wěn)定性顯得尤為重要。本試驗(yàn)采用鹽酸浸提法從發(fā)酵牛肉香腸中得到具有強(qiáng)抗氧化活性的多肽，研究熱處理、pH值、金屬離子、常溫貯存時(shí)間及模擬胃腸消化對(duì)其抗氧化活性的影響，為發(fā)酵牛肉香腸肽作為功能性食品和抗氧化劑的開發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論和試驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1材料與試劑牛后腿肉，采自甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司；豬背膘、腸衣、食鹽等，購于江蘇雨潤(rùn)肉食品有限公司；發(fā)酵劑(包括乳酸片球菌與戊糖片球菌)，科漢森食品添加劑有限公司；DPPH、亞硝酸鈉、抗壞血酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶，日本Solarbio公司；濃硫酸、濃鹽酸

4、、三氯乙酸、水楊酸等(分析純)，乙腈、甲醇、正己烷等(色譜純)，蘭州新區(qū)鑫鑫尚信試劑經(jīng)銷部。1.2儀器與設(shè)備H2050R全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)，北京海天友誠科技有限公司；RE-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SPectramaxM2型酶標(biāo)儀，美國美谷分子儀器有限公司；FR-500型組織勻漿機(jī)，寧波新芝科器研究所；UV-8000T型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；RigolL3000高效液相色譜儀，德國SYKAM公司；ES2030冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。1.3試驗(yàn)方法1.3.1發(fā)酵牛肉香腸的制備工藝流程如下：原料肉預(yù)處理瘦肉絞碎、肥肉切丁添加輔料、攪拌腌制灌腸

5、發(fā)酵干燥成熟真空包裝成品操作要點(diǎn)：牛后腿肉要求新鮮，無筋膜、淤血及其他雜質(zhì)，與豬背部脂肪一起漂洗干凈，將瘦肉攪碎，肥肉切丁，按m(肥)m(瘦)=28混合，以混合后的肉質(zhì)量為基礎(chǔ)，其他配料按鹽2.5%、抗壞血酸0.05%、亞硝酸鈉0.005%、蔗糖1%、葡萄糖1%、水10%和發(fā)酵劑0.025%添加(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))不斷攪拌直至調(diào)料均勻，顏色均一，肉餡之間有黏連性，然后在4腌制12h。將腌制后的肉餡灌入腸衣，灌裝過程中應(yīng)注意排氣，防止腸體爆裂，灌裝后的腸體應(yīng)飽滿緊繃，無肉眼可見氣泡。腸體清洗干凈后在24和92%相對(duì)濕度下發(fā)酵3d，然后在14和77%相對(duì)濕度條件發(fā)酵并干燥32d。取樣時(shí)，應(yīng)去除腸衣，避

6、免裸露產(chǎn)品表皮黏上白霉。1.3.2多肽的提取10準(zhǔn)確稱取20g樣品，加入120mL0.06mol/LHCl，勻漿(10000r/min，20s3)，靜置(4，2h)，離心(10000r/min，4，20min)。上清液經(jīng)紗布過濾后加入4倍體積30%乙醇，靜置過夜(12h)，相同條件下再次離心，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥得到多肽粉末。1.3.3體外抗氧化能力的測(cè)定按照ZHU等10的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力；參考馮美琴等11的方法測(cè)定羥自由基清除能力和鐵還原抗氧化能力(ferricreducingantioxidantpower,FRAP)；參照YANG等12的方法測(cè)定清除超氧陰離子自由基的

7、能力。1.3.4乳化活性與乳化穩(wěn)定性的測(cè)定參照GUO等13的方法測(cè)定乳化活性(emulsifyingactivityindex，EAI)與乳化穩(wěn)定性(emulsifyingstabilityindex，ESI)。以91的體積比將多肽溶液與大豆油混合，乳化1min后立即在距燒杯底5mm處吸取30L乳化液，均勻分散在3mL0.1%十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)溶液中，測(cè)定500nm處吸光度值，同時(shí)以0.1%SDS溶液作為空白。計(jì)算如公式(1)和公式(2)所示：(1)(2)式中：A0、A10,靜置0、10min的吸光度；D,稀釋倍數(shù)；c,肽溶液的質(zhì)量濃度，g/mL

8、；,油相體積分?jǐn)?shù)；10000,校正系數(shù)。1.3.5起泡特性與泡沫穩(wěn)定性參考張京濤等14的方法，多肽起泡特性的計(jì)算如公式(3)和公式(4)所示：起泡能力(3)泡沫穩(wěn)定性(4)式中：V0、V30分別表示勻漿液靜置0、30min的泡沫體積。1.3.6游離氨基酸組成的測(cè)定將100L樣品、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(17種，2.5mol/mL)、三乙胺乙腈溶液(pH7.0)混合，加入10L正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液和50L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，靜置1h(25)，再加入200L正己烷，靜置10min，下層溶液用0.45m濾膜過濾后上樣分析。高效液相色譜采用KromasilC18反相色譜柱(250mm4.6mm，5m)；進(jìn)樣量

9、為10L；柱溫為40；流速為1mL/min；無水乙酸鈉-乙腈水溶液(pH6.5)作為流動(dòng)相A；80%乙腈水溶液作為流動(dòng)相B。1.3.7發(fā)酵牛肉香腸肽體外抗氧化能力的穩(wěn)定性研究1.3.7.1熱處理對(duì)多肽抗氧化活性的影響將多肽在室溫、40、60、80、100溫度下分別處理20min以及在100條件下分別處理0、10、20、30、40min，冷卻至室溫測(cè)定DPPH自由基清除率、FRAP。1.3.7.2pH對(duì)多肽抗氧化活性的影響用HCl和NaOH(1mol/L)調(diào)整多肽溶液pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫振蕩反應(yīng)2h，測(cè)定DPPH自由基清除率、FRAP。1.3.7.3金屬離子

10、對(duì)多肽抗氧化活性的影響配制質(zhì)量濃度為2g/L的肽液，分別添加0、50、100、150、200、250mg/L的NaCl和KCl，室溫振蕩反應(yīng)2h，測(cè)定樣品的抗氧化能力。1.3.7.4貯存時(shí)間對(duì)多肽抗氧化活性的影響將多肽提取液在常溫下分別存放0、1、2、3、4d，然后按照上述方法測(cè)其活性，研究貯存時(shí)間對(duì)其抗氧化活性的影響。1.3.7.5模擬胃腸消化對(duì)多肽抗氧化活性的影響參照ZHU等10的方法并稍作修改。將多肽液pH值用HCl(1mol/L)調(diào)至2.0，添加胃蛋白酶(3000U/mg)，保持溫度37，持續(xù)酶解2h，酶解液置于沸水浴中滅酶10min，冷卻至室溫后離心(4、6000r/min，10mi

11、n)。將上清液分為2份，1份用于測(cè)定多肽液經(jīng)模擬胃消化后抗氧化活性的變化，另1份用NaOH(1mol/L)調(diào)pH至7.0，添加胰蛋白酶(250U/mg)，保持溫度37，持續(xù)酶解2h后滅酶，冷卻，離心，收集上清液，-20貯存?zhèn)溆谩?.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)處理做3次重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示，P0.05表示差異顯著，采用Origin9.0軟件進(jìn)行繪圖。2結(jié)果與分析2.1熱處理對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響熱處理是食品加工中常用的手段，在較高溫度下多肽能否保持高活性，是評(píng)價(jià)其是否具有商業(yè)潛力的重要因素6。由圖1-a可知，常溫時(shí)DPPH自由基清除活性

12、為69.8%，100時(shí)清除活性為72.2%，升高了2.4%。這可能是因?yàn)楦邷靥幚黼m然改變了多肽的空間構(gòu)象，但其肽鏈并沒有斷裂，只是部分二級(jí)結(jié)構(gòu)展開，暴露出一些活性位點(diǎn)，使DPPH自由基清除活性增強(qiáng)15。FRAP值在40時(shí)顯著下降(P0.05)，之后溫度對(duì)其無顯著影響(P0.05)。圖1-b是同一溫度不同處理時(shí)間對(duì)樣品抗氧化能力的影響。DPPH自由基清除活性和FRAP值在加熱10min時(shí)顯著下降(P0.05)，20min后加熱時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除活性無顯著影響(P0.05)，F(xiàn)RAP在30min時(shí)最高。肖嵐等16發(fā)現(xiàn)牦牛血低聚肽的羥自由基清除活性在100處理5h仍有84.32%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果

13、一致。因此，發(fā)酵牛肉香腸肽具有較好的熱穩(wěn)定性，在其提取和加工處理中，熱處理并不會(huì)影響其活性。2.2pH對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響pH可通過影響肽的電離勢(shì)和電子轉(zhuǎn)移能力來影響肽的抗氧化活性5。由圖2可知，在pH為3.0時(shí)，發(fā)酵香腸肽的DPPH自由基清除活性和FRAP值最高，分別為91.64%和0.306，之后隨著pH上升顯著下降(P0.05)。在中性環(huán)境(pH7.0)時(shí)，DPPH自由基清除活性仍能保持70%以上，當(dāng)其處于堿性環(huán)境(pH11.0)，清除活性較pH3.0下降了46.56%。因此，發(fā)酵香腸中多肽的DPPH自由基清除活性對(duì)堿性環(huán)境更敏感，肽類物質(zhì)在堿性環(huán)境下會(huì)發(fā)生脫酰胺或外消旋反應(yīng)，從

14、而導(dǎo)致多肽活性下降5。綜上所述，發(fā)酵牛肉香腸肽的耐堿性較弱，為了保持較好的抗氧化活性，應(yīng)避免其處于強(qiáng)堿性環(huán)境中。a-熱處理溫度對(duì)發(fā)酵香腸肽DPPH自由基清除率的影響；b-熱處理時(shí)間對(duì)發(fā)酵香腸肽DPPH自由基清除率的影響圖1熱處理對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.1Changesinantioxidantactivitiesofpeptidesextractedfromfermentedsausagesindifferenttemperature注：圖中小寫字母不同表示不同處理間DPPH自由基清除能力差異顯著(P0.05)，大寫字母不同表示還原力差異顯著(P0.05)(下同)圖2pH對(duì)發(fā)酵香腸

15、肽抗氧化活性的影響Fig.2ChangesinantioxidantactivitiesofpeptidesextractedfromfermentedsausagesindifferentpH2.3金屬離子對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響食品體系中金屬離子廣泛存在，攝入適量金屬離子對(duì)機(jī)體的生理平衡有重要意義6。由圖3-a可以看出，隨著Na+濃度的提高，多肽的DPPH自由基清除活性顯著上升，當(dāng)Na+質(zhì)量濃度為150mg/L時(shí)，DPPH自由基清除活性達(dá)到最大值84.77%；相反地，F(xiàn)RAP值隨Na+濃度升高顯著降低(P0.05)；當(dāng)Na+質(zhì)量濃度為200mg/L時(shí)，DPPH自由基清除活性和FRAP值

16、均能達(dá)到較高水平。可能是因?yàn)镹aCl溶液電離產(chǎn)生的Cl-和Na+能中和香腸多肽表面的電荷，使水化膜遭到破環(huán)，暴露出的供氫或供質(zhì)子體與自由基結(jié)合，抗氧化活性隨之增強(qiáng)9。圖3-b反映的是K+濃度對(duì)多肽抗氧化能力的影響。當(dāng)K+的質(zhì)量濃度為50mg/L時(shí)，DPPH自由基清除活性達(dá)到最大值86.87%，但此時(shí)FRAP下降至最低值；當(dāng)K+的質(zhì)量濃度為150mg/L時(shí)，DPPH自由基清除活性和FRAP值均維持在較高水平。PEREIRA等17研究指出肽與含有NaCl的食品基質(zhì)之間的相互作用有利于肽生物活性的維持；孫浩等7研究發(fā)現(xiàn)K+會(huì)提高苦蕎抗氧化肽AFYRW的OH清除率，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。綜上，適量的

17、Na+、K+會(huì)增強(qiáng)發(fā)酵牛肉香腸肽的抗氧化活性，Na+質(zhì)量濃度為200mg/L，K+質(zhì)量濃度為150mg/L時(shí)抗氧化活性最好。a-Na+濃度對(duì)抗氧化活性的影響；b-K+濃度對(duì)抗氧化活性的影響圖3Na+、K+濃度對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.3ChangesinantioxidantactivitiesofpeptidesextractedfromfermentedsausagesindifferentNa+andK+contents2.4貯存時(shí)間對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響發(fā)酵香腸肽在提取分離過程中易長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，對(duì)活性產(chǎn)生影響。圖4為其室溫下處理0、1、2、3、4d的結(jié)果。當(dāng)處理1

18、d時(shí)，與對(duì)照相比DPPH自由基清除活性上升了約10%，當(dāng)處理2d時(shí)，活性下降顯著(P0.05)，之后隨處理時(shí)間延長(zhǎng)無顯著變化(P0.05)，F(xiàn)RAP整體變化差異不顯著(P0.05)?？赡苁且?yàn)殡亩伪┞对诳諝庵邪l(fā)生了氧化反應(yīng)或吸濕后發(fā)生了水解反應(yīng)，導(dǎo)致多肽結(jié)構(gòu)和氨基酸組成發(fā)生改變，使活性降低18。因此，對(duì)發(fā)酵牛肉香腸肽進(jìn)行提取和分離時(shí)，應(yīng)注意控制溫度和時(shí)間，避免其長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中。圖4貯存時(shí)間對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.4Changesinantioxidantactivitiesofpeptidesextractedfromfermentedsausagesindifferentst

19、oragetime2.5模擬胃腸消化對(duì)發(fā)酵香腸肽活性的影響2.5.1模擬胃腸消化對(duì)發(fā)酵香腸肽乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響由圖5可知，EAI與ESI的變化相似，經(jīng)過2h模擬胃消化后，EAI和ESI顯著升高62%和16%(P0.05)。這可能是因?yàn)殡亩卧谖傅鞍酌傅淖饔孟鲁掷m(xù)水解，分子質(zhì)量變小，一些疏水性基團(tuán)暴露出來，增強(qiáng)了與油的結(jié)合能力，從而提高多肽乳化性19。在添加胰蛋白酶后，EAI和ESI顯著下降(P0.05)，但EAI仍保持在80%以上，此時(shí)與消化前相比EAI升高了43%，ESI降低了18%?？赡苁且?yàn)殡S著胰蛋白酶的進(jìn)一步作用，小分子肽水解過度，疏水基團(tuán)暴露過多，打破了形成表面活性層的平衡，降

20、低了乳化性能13?？偟膩碚f，模擬胃腸消化對(duì)香腸肽的乳化活性有一定提高，但不利于乳化穩(wěn)定性。2.5.2模擬胃腸消化對(duì)發(fā)酵香腸肽起泡特性的影響蛋白質(zhì)起泡性與蛋白質(zhì)的分子大小及表面極性基團(tuán)有關(guān)，分子大小越合適，極性基團(tuán)越多，起泡性就越高20。香腸肽仍以蛋白質(zhì)為主體物質(zhì)，可見其具有一定的乳化性能。由圖6可知，多肽起泡性和泡沫穩(wěn)定性經(jīng)2h模擬胃消化后顯著升高(P0.05)，經(jīng)第二階段模擬腸道消化后又顯著降低(P0.05)，較消化前起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別升高15%和11.7%。在一定酶解范圍內(nèi)，分子質(zhì)量越小溶解性越好，此時(shí)更多的肽分子參與液膜的形成，起泡性增強(qiáng)，但肽鏈太短會(huì)使泡沫表面黏彈性降低，液膜間作用

21、變?nèi)?，最終導(dǎo)致起泡性隨分子質(zhì)量減小反而下降14?？偟膩碚f，香腸多肽經(jīng)模擬胃腸消化后具有較好的起泡特性。圖5模擬胃腸消化對(duì)發(fā)酵香腸肽乳化特性的影響Fig.5Effectsofsimulatedgastrointestinaldigestiononemulsifyingpropertiesofpeptidesextractedfromfermentedsausages圖6模擬胃腸消化對(duì)發(fā)酵香腸肽起泡特性的影響Fig.6Effectsofsimulatedgastrointestinaldigestiononfoamingcharacteristicsofpeptidesextractedfromf

22、ermentedsausages2.5.3模擬胃腸消化對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響由圖7可知，經(jīng)2h模擬胃消化后，DPPH自由基清除活性增加至74.2%(P0.05)，這可能是因?yàn)樵谀M胃消化過程中暴露出更多的疏水性氨基酸側(cè)鏈8。再經(jīng)過第二階段模擬腸消化后，DPPH自由基清除活性又顯著下降至57.23%(P0.05)?？赡苁且?yàn)榻?jīng)胰蛋白酶進(jìn)一步酶解后，部分活性多肽裂解，疏水基團(tuán)暴露過度，導(dǎo)致抗氧化活性降低9。清除超氧陰離子自由基的能力與DPPH自由基清除活性變化相似，經(jīng)胃蛋白酶消化后，清除率從45.5%顯著升高到74.5%，再經(jīng)胰蛋白酶消化后又顯著下降至64.1%(P0.05)。羥自由基清除活性在2個(gè)消化階段均顯著升高(P0.05)，這與張淼21發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物經(jīng)體外消化后羥自由基清除能力顯著增加的結(jié)果相似。模擬消化結(jié)束后，F(xiàn)RAP值從0.439顯著增加至0.518(P0.05)，這可能與酶解液中顯著增多的中性和酸性氨基酸有關(guān)22。經(jīng)過模擬胃腸消化，多肽的羥自由基、超氧陰離子自由基清除活性及FRAP值分別升高31.86%、18.6%和0.079(P0.05)。綜上，發(fā)酵香腸中多肽含有抗氧化活性片段，且其被人體吸收后仍能發(fā)揮較大作用。圖7模擬胃腸消化對(duì)發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.7Effectsofsimulatedgastroi