基因工程工具酶 (2)講稿

1、關(guān)于基因工程工具酶 (2)第一張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、 限制酶的用途第二張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.I型：由三個基因構(gòu)成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復(fù)合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸），無特異切

2、割位點。2.II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在. coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.III型：修飾酶與型酶相同，hsd與hsd基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。 上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。第三張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名 1. 定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：Hind前三個字母來自于菌種名稱H. influenzae，“”表示菌系為型血清型；“”表示分離到的第三個限

3、制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I ()第四張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）、限制酶的特點 1. 識別順序和酶切位點 ）識別-8個相連的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG Fok I 5-()9-3 3-()13-5 外側(cè)，產(chǎn)生

4、-端突起 ）富含第五張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 ）對稱性雙對稱 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 ）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外 ）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是-和- 2.末端種類 ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5 ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5 粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別位點的D

5、NA分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組DNA分子。在進(jìn)行DNA重組時，應(yīng)用限制酶同時切割目的基因和載體DNA，使之產(chǎn)生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組DNA分子第六張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 ）平齊末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互補(bǔ)的粘性末端 ）切點在識別順序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ）能識別簡并順序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; C T

6、CGGG; CCCGAG; CTCGAG 第七張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 5- GAATTC-33- CTTAAG -55- GTTAAC-33- CAATTG -5EcoR的識別序列Hae的識別序列第八張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN33NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN55NNNNNG 3NNNNNCTTAApEcoR的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5第九張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN5

7、5NNNNNGTT pAACNNNNN33NNNNNCAAp TTGNNNNN5Hae的識別序列和酶切切口（平端）第十張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月酶切條件：酶切緩沖液低鹽組：050mmol/L NaCl中鹽組：50100mmol/L NaCl高鹽組：100150mmol/L NaCl第十一張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶） 1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 酶 2. 特點：1）識別相同順序 2）切割位點的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI

8、 CCGC GG 第十二張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）、 限制酶的用途 1. DNA重組 2. 限制酶（物理）圖譜繪制 3. 突變分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點 1. 具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。 2. 酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，1- 20nt。 3. 酶切后的末端經(jīng)補(bǔ)平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。 4. 產(chǎn)生粘性末端可以是1-5個核苷酸。 5. 均為單體，分子量為47108 kD。第十三張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月酶切圖譜的構(gòu)建（a）請構(gòu)建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜第十四

9、張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月酶切圖譜的構(gòu)建（b）第十五張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、DNA甲基化酶（一）、 甲基化酶的種類與識別順序1. 限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶 三個系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。 在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同第十六張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2

10、022年6月2. II型甲基化酶對限制酶活性的影響 ） 抑制同種限制酶的活性 M.BamHI GGATmCCBamHI(GGATCC)M.EcoRI GAmATTCEcoRI(GAATTC) ） 抑制不同種限制酶的活性 a. 順序完全重疊 如：M. ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA） b. 順序邊界重疊 如：M. BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG） ） 抑制不同種限制酶的部分活性 MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3. 甲基化酶的用途 ） 改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組

11、體的形成 ） 在建立基因文庫時，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切第十七張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接RERERE第十八張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、核酸酶（一）、外切酶III（ExoIII） 1. 一般特點： 來自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反應(yīng)類型 1) 外切酶活性：35，產(chǎn)生5-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 2) 核酸酶H活性：除去DNA-

12、RNA雜交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 3) 3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，pH 6.8-7.4 4) 內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，pH 7.6-8.5第十九張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.外切酶活性特點 1) 反應(yīng)底物：互補(bǔ)ds-DNA 2) 堿基釋放速度：CA-TG 3) 反應(yīng)產(chǎn)物：5-單磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，過度反應(yīng)將導(dǎo)致DNA降解 4.用途 1) 核酸（DNA）標(biāo)記 2) 基因突變-缺失 3) DNA序列測定時作順序缺失 5.使用注意事項 1) 正式使用前，測定在一定條件下酶的

13、反應(yīng)速度 2) 在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(qū)(來自于cDNA加尾)第二十張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口, 缺口, 斷口缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut)3HO P53HO P5第二十一張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用第二十二張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4

14、 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b cExoIII用于順序缺失 ExoIII ExoIII -32P -32P dCTP dCTP 5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于DNA標(biāo)記第二十三張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、RNase（三）、RNaseH（二）、RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。 1. RNase A 分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100加熱15min仍具活性）, 用于除去DNA樣品中的R

15、NA分子 2. 核酸酶S7，亦稱微球菌核酸酶，對RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA （三）、RNase H 作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。 第二十四張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）、 DNase I1. 特點：具內(nèi)切酶活性，作用于ds -DNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活達(dá)最大值 當(dāng)酶濃度很低時，ds -DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg 2+存在時，兩條鏈上的切口

16、獨立無關(guān)，Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置 2. 用途 1) 切口移位，制備DNA探針 2) 制備RNA樣品時除去DNA分子 3) 基因突變時產(chǎn)生切口 第二十五張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 Mn+存在時 Mg+存在時 DNaseI作用特點DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI與Pol I 的切口移位Pol I第二十六張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、聚合酶包括DNA聚合酶和RNA聚合酶（一）、E.coli DNA聚合酶I（polI） 1. E.coli 的DNA聚合酶系統(tǒng) Pol I 參與DNA修復(fù), 具35和53外切酶活性 pol II 同

17、上 具35外切酶活性 pol III 參與DNA復(fù)制, 具35和53外切酶活性 2. E.coli polI的特點 1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響 3） 外切酶活性 第二十七張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 用途 1） 除去3-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時） 2） 補(bǔ)齊5-突起端 3） 合成第二條cDNA 4） 切口移位制備探針 其中用途2)

18、和3)常用大片段第二十八張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、 T4 DNA聚合酶 1. 特點： 53聚合酶活性，1500 nt/min, 為pol I的兩倍 35外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分別為40和 4000nt/min, 缺少5到3的外切核酸酶活性. 2.用途： 制備高比活性探針(1010 cpm/gDNA); DNA末端修飾-缺失 外切酶活性 聚合酶活性 無dNTP dNTP第二十九張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(三) T7 噬菌體DNA聚合酶具3到5端外切核酸酶活性和持續(xù)合成能力較低的DNA聚合酶活性.應(yīng)用: 1)合成DNA能力

19、很強(qiáng),可用于延伸很長的模板. 2)可用于定點誘變中互補(bǔ)鏈的合成. 3) 3末端的標(biāo)記4)將雙鏈DNA的黏性末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉?第三十張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）、Taq DNA聚合酶1. 特點： 分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75， 對95高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在35外切酶活性2. 用途： 主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個DNA 分子因而可被擴(kuò)增4106倍。 DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個步驟： DNA模板變性(95) 與DNA引物退火(45) 引物延伸(75) 第三十一張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于

20、2022年6月Taq Pol 和PCR 5 3 變性 3 5 5 3 引物 3 5 復(fù)性 5 3 5 3 3 5 引物 3 5 5 3 延伸 5 3 3 5 3 5 第三十二張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(五) 不倚賴于模板的DNA聚合酶末端轉(zhuǎn)移酶特點:催化dNTP到DNA的3羥基端,不需要模板,但需要2價陽離子.應(yīng)用:1)克隆DNA片段.同聚物加尾.2)用32P標(biāo)記DNA的3末端.3)在DNA的3末端摻入非放射性的標(biāo)簽.4)合成多脫氧核苷酸同聚體.第三十三張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(六) 倚賴RNA的DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA克隆補(bǔ)平和標(biāo)記5端突出的DNA片段的3末端.代替Klenow酶第三十四張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(七) 倚賴DNA的RNA聚合酶噬菌體的RNA聚合酶: SP6,T7和T3應(yīng)用:產(chǎn)生均勻標(biāo)記的高比活性單鏈RNA探針(原位雜交)第三十五張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(八)不倚賴DNA的RNA聚合酶poly(A)聚合酶應(yīng)用: 用32P標(biāo)記RNA的3端 加尾(poly(A)第三十六張，PPT共四十二頁，創(chuàng)作于2022年6月五、連接酶（一）、T4 DNA連接酶 1. 特點： 只連接ds -DNA分子，要求3