高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定鄰苯二甲酸酯

1、不得用于商業(yè)用途不得用于商業(yè)用途實(shí)驗(yàn)七高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定鄰苯二甲酸酯實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)高效液相色譜儀的基本操作方法。2、了解高效液相色譜儀原理和條件設(shè)定方法。3、了解高效液相色譜法在日常分析中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)原理高效液相色譜法是以液體作為流動(dòng)相，借助于高壓輸液泵獲得相對(duì)較高流速的液流以提高分離速度、并采用顆粒極細(xì)的高效固定相制成的色譜柱進(jìn)行分離和分析的一種色譜方法。在高效液相色譜中，若采用非極性固定相，如十八烷基鍵合相，極性流動(dòng)相，即構(gòu)成反相色譜分離系統(tǒng)。反之，則稱(chēng)為正相色譜分離系統(tǒng)。反相色譜系統(tǒng)所使用的流動(dòng)相成本較低，應(yīng)用也更為廣泛。定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)

2、峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計(jì)算公式為：R=2t-t/1.7*(W+W)(R2)(R1)12式中t為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；t為相鄰兩峰中前一峰的保留(R2)(R1)時(shí)間；W及W為此相鄰兩峰的半峰寬。除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。12本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為鄰苯二甲酸酯，又稱(chēng)酞酸酯，縮寫(xiě)PAE，常被用作塑料增塑劑。它被普遍應(yīng)用于玩具、食品包裝材料、醫(yī)用血袋和膠管、乙烯地板和壁紙、清潔劑、潤(rùn)滑油、個(gè)人護(hù)理用品，如指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液等數(shù)百種產(chǎn)品中。但研究表明，鄰苯二甲酸酯在人體和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著類(lèi)似雌性激素的作用，是一類(lèi)內(nèi)分泌干擾物。待測(cè)物性質(zhì)見(jiàn)表1。表1色譜柱測(cè)試條件出峰次序樣

3、品組成1鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)2鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)3鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)如果要檢測(cè)不同條件對(duì)譜圖分離的影響，可按表1配制幾種物質(zhì)的混合溶液，在不同條件下進(jìn)行HPLC分離檢測(cè)。儀器與試劑1、儀器Agilent1100高效液相色譜儀，50ul微量注射器。2、試劑甲醇(色譜專(zhuān)用)，高純水實(shí)驗(yàn)步驟1、色譜條件色譜柱：辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)柱溫：室溫流動(dòng)相：初始為高純水：30，甲醇：70檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣體積：lOOpl定量環(huán)，實(shí)際注射每次可控制在200pl。2、待測(cè)溶液的配制首先用甲醇做溶劑配制儲(chǔ)備液：鄰苯二甲酸二甲酯(0.3880g/L)，鄰苯二甲

4、酸二乙酯(0.2770g/L)，鄰苯二甲酸二丁酯(0.3776g/L)。然后各取1mL儲(chǔ)備液用水和甲醇(20：80)稀釋至10mL，作為待測(cè)溶液。3、色譜測(cè)定按操作規(guī)程開(kāi)啟電腦，開(kāi)啟脫氣機(jī)、泵、檢測(cè)器等的電源，啟動(dòng)Agilent1100在線(xiàn)工作軟件，設(shè)定操作條件。流量為1.000ml/min。待儀器穩(wěn)定后，開(kāi)始進(jìn)樣。將進(jìn)樣閥柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入儀器進(jìn)樣口，順時(shí)針?lè)较虬鈩?dòng)進(jìn)樣閥至“INJECT”位置,此時(shí)顯示屏顯示進(jìn)樣標(biāo)志。記下各組分色譜峰的保留時(shí)間及峰面積及分離比。實(shí)驗(yàn)完畢，清洗系統(tǒng)及色譜柱。依次用甲醇-水(60：40)、甲醇-水(70：30)直到純

5、甲醇作流動(dòng)相清洗，每次清洗至基線(xiàn)走穩(wěn)，至少清洗15min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)流動(dòng)相的比例為：高純水：20%甲醇：80%，流速為1.0ml/min,記錄色譜圖,并計(jì)算分離度；11.017206,426.60.10812.7160.11721.29816105.85703.20.12930.63926.06611.017206,426.60.10812.7160.11721.29816105.85703.20.12930.63926.06631.6064177D.55694.50.12050.71923.61542.39716.21.40.1530.3880.0Q952.726.35.3E-10.17

6、890.890.00463.182768,5127,50.09360.8110.43473.57223.1E-10.1051.2530.00183.8185552.39180.09391.0013.139g4.07482455.斗5659.40.2340.753怖,616文件皆息啦方法和運(yùn)行控制韻數(shù)抿分析當(dāng)抿告版面設(shè)計(jì)邕認(rèn)證(OQ/PV)LU-文件2014-05-06A003.D丈件路徑D:X：HEM321V)ATA2014YF日期Oe-May-14,08:57:05樣品Bl樣品信息條形碼操作者系統(tǒng)方法80.M壘比分析時(shí)間4.994min采樣頻車(chē)0.0049min(0,294sec),1030

7、數(shù)據(jù)點(diǎn)根據(jù)分離度公式：1:1一坨D.5(W1-W2)計(jì)算分離度：R1=2.466，R2=13.92曹HPLC_12&0(脫機(jī):數(shù)據(jù)分析I回文件(F)方法(M)序列重新計(jì)算(U圖形(G)積分校正(Q報(bào)告(R)批處涯(B)視圖(V)中斷(A)幫助(H)曰(3D:CHEM321DATA-口單次運(yùn)行由口14041501軒口2014YFE-C2CC爭(zhēng)口DEMO審口DOUQIANHPLCSIRENZU審口PRANAV爭(zhēng)DSC審口WNN由口WUYANGE審口WYG1104審口YIQISHIYAN甘口YJ-FRIDAY審口ZYJ由口房昊(2)流動(dòng)相的比例為：高純水：20%甲醇：80%；流速為0.5ml/min

8、,記錄色譜圖，并計(jì)算分離度；min報(bào)告版面役計(jì)認(rèn)證(OQ/PV)文件(F)方法(M)序列重新計(jì)算(U圖形(G)積分校正(Q報(bào)告(R)批婕(B)min報(bào)告版面役計(jì)認(rèn)證(OQ/PV)文件(F)方法(M)序列重新計(jì)算(U圖形(G)積分校正(Q報(bào)告(R)批婕(B)視圖M中斷(A)幫助(H)?信號(hào)蹴睦I朋電j為單貞姮行14041501?(114YFDOUQIANHPLCSIRENZU審口PRANAV軒口SC審口WNN審口WUYANGE審口WYG1104由口YIQISHIYANl+l-rjYJ-FRIDAY方法和迄行控制13S1LgMJr7J!/VViEnrTTI賈趙回回冋辭斜Ij豈令LG文件2014-0

9、5-06A005.D文件路徑D:CHEM321V3ATA2014YF日期06-May-14r09:26:40樣品Bl樣品信息築形碼操作者系統(tǒng)方注80.M蚤比分析時(shí)間9.993min采樣頻車(chē)0.0049min(0,294sec),2060數(shù)據(jù)點(diǎn)目7丘1_畫(huà)圖臨傷中。，鍛虱亠卩10:29112014/5/6根據(jù)分離度公式：1:1一垃05(Wl-W2)計(jì)算分離度：R1=3.136，R2=17.29(3)流動(dòng)相的比例為：高純水：30%，甲醇：70%，流速為1.0ml/min,記錄色譜圖，并計(jì)算分離度；min倉(cāng)HPLC1260(脫機(jī)):數(shù)垢分析文件(F)方法(M)序列重新計(jì)算(L)圉形(G)積分校正(C

10、)報(bào)告(R)批瞬(B)視圖(V)中斷(A)幫助(H)信號(hào)Q臉I(yè)說(shuō)用吐扁數(shù)據(jù)分析LJUUQ1ANHPLCSIRENZU單貞匹行14041501由口2014YFCSV34D:CHEM321DATA2014YFGROUPB謐-70-1.csv已躺2彩5(localhost節(jié)HI色、*-2.iay8U11110ioPKANAVSC+$WNN軒口WUYANGE審C3WYG1104國(guó)口YIQISHIYAN審口YJ-FRIDAY由口ZYJSJ口房昊方法扣運(yùn)行控制報(bào)告版面設(shè)計(jì)認(rèn)證(OQ/PV)10.3211.67.1E-20.32750.3490.0Q120.942194,331.60.08910.7920.

11、07331.235270,1350.10741.5190.10141.54545239.75668.30.12810.68516.99551.8432929.6535.80.08710.7451.10162.32847945.45685.90.13330.71518.01172.90622823.20.13810.470.08683.44115.21.70.13040.4740.00693.61323.21.20.25370.1870.009104.1619.57.6E-10.33450.3070.007114.9555.63.9E-10.20890.9190.002125.277.45.4E

12、-10.19390.860.0Q3135.7557.12.9E-10.33280.9030.003146.43113.71.30.15590.990.005156.801620.458.60.16430.7650.233167.6285.43.7E-10.21540.8180.002178.10611.5&5E-10.25411.0790.004189.1323.38.8E-20.45920.7720.0011910.-A835269.6343,10.23740.8131.9802010.99131*10.3254.40.19061.4911.1802111.383160230.45660.5

13、0.34770.60260.1912213.57820.5&9E-10.42880.5510.008根據(jù)分離度公式：Dn5(Vl-W2)計(jì)算分離度：R=5991，R2=3765(4)定性過(guò)程(混合物和DEP)：實(shí)驗(yàn)得到如下的色譜圖下:文件(F)方法(M)序重新計(jì)算(L圖形(G)積分校正(Q報(bào)告(R)批處理(B)視圏(V)中斷(A)幫助(H)曰RD:CHEM321DATA-|單次運(yùn)行審口14041501審2014YF曲口CC軒口DEMO審口DOUQIAN曰RD:CHEM321DATA-|單次運(yùn)行審口14041501審2014YF曲口CC軒口DEMO審口DOUQIAN審口HPLCSIRENZU審H

14、SX爭(zhēng)口HZD軒口LHM審口PRANAV軒口SC審口WNN審口WUYANGE審口WYG1104由口YIQISHIYAN審口YJ-FRIDAY由口ZYJS)口房昊TV:.間數(shù)據(jù)|方法電方法和運(yùn)行控制霞、數(shù)拯分析膏報(bào)告版面設(shè)計(jì)認(rèn)證(OQ/PV)LC-文件2014-05-06A004.D文件路徑D:X；HEM321V3ATA2014YF日期06-May-14r09:13:09樣品Bl樣品信息築形碼操作者系統(tǒng)方注80.M蚤比分析時(shí)間4.994min采樣頻車(chē)0.0049min(0.294sec),1030數(shù)據(jù)點(diǎn)文件信息-1-畫(huà)圖臨傷中。，空虱亠卩強(qiáng)12“10:31|F2014/5/6由圖可以看出，混合溶

15、液的出峰順序?yàn)椋亨彵蕉姿岫柞ァ⑧彵蕉姿岫阴?、鄰苯二甲酸二丁酯。思考題比較圖2和圖3可知，在緩沖液作流動(dòng)相的情況下，實(shí)驗(yàn)得出的峰形較好。但為什么實(shí)驗(yàn)室盡量不用緩沖溶液作流動(dòng)相？&AO3i3WW.c5tnALP!圖2緩沖液作流動(dòng)相得出的色譜圖圖3乙腈-水（5：95）作流動(dòng)相得出的色譜圖答：因?yàn)榫彌_溶液對(duì)色譜柱的損傷較大，使用后，不易清洗，成本高，并且這種對(duì)色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的。（2）流動(dòng)相在使用前為什么要用砂芯漏斗過(guò)濾？答：HPLC要求流動(dòng)相非常的純凈，否則他會(huì)對(duì)色譜柱和儀器產(chǎn)生不可逆損壞。由于色譜柱填料顆粒很細(xì)，內(nèi)腔很小，流動(dòng)相中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管堵塞；而

16、儀器進(jìn)樣閥也易被小顆粒堵塞，因此流動(dòng)相在使用前要用砂芯漏斗過(guò)濾。（3）請(qǐng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，怎樣清洗柱子。分為兩種情況，第一種情況為流動(dòng)相用到緩沖溶液，第二種情況為流動(dòng)相不用緩沖溶液？答：分析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，先將體系中鹽分去除干凈，再依次用甲醇：水（60：40）、甲醇：水（70：30）直到純甲醇作流動(dòng)相清洗清洗柱子，并最后灌滿(mǎn)。對(duì)于不用緩沖溶液：以20倍柱體積或更多一些的強(qiáng)溶劑加以清洗?？梢栽诩状肌⒁译娴人苄匀軇┲?，改用50%DMSO或DMF水溶液加以清洗。清洗幾十倍柱體積后，再逐步置換返回原系統(tǒng)（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，流動(dòng)相中水的比例多少對(duì)分離度、出峰時(shí)間的影響及流速對(duì)分離度的影響。答：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)，可以看出，流動(dòng)相中水的比例越高（或甲醇比例越低），流速越小，分離度越高，出峰時(shí)間越晚；水的比例減小，分離度也減小，但出峰時(shí)間加快。所以應(yīng)選擇一個(gè)合適的流動(dòng)相比例。僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途。Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;notforcommercialuse.Nur