淺談石蠟切片制作存在問題

1、淺談白臘切片的制作與存在問題綱要:白臘切片是察看植物組織結(jié)構(gòu)常用的制片方法之一?；畹募?xì)胞或組織多為無色透明,各樣組織間和細(xì)胞內(nèi)各樣結(jié)構(gòu)之間均缺少反差,在一般光鏡下不易清楚差別;組織走開機(jī)體后很快就會(huì)死亡和產(chǎn)生組織腐敗,失掉原有正常結(jié)構(gòu),所以,察看植物葉片結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，組織經(jīng)固定、白臘包埋、切片及染色等步驟后完滿保留細(xì)胞原有狀態(tài)，并且能清楚辨識其形態(tài)結(jié)構(gòu)。重點(diǎn)詞：白臘切片；組織；染色；形態(tài)結(jié)構(gòu)白臘切片(paraffinsection)白臘制片又叫永遠(yuǎn)制片,組織學(xué)慣例制片技術(shù)中最為寬泛應(yīng)用的方法。其長處主假如合適各樣植物組織的制片,切片的厚薄易于控制(最薄可達(dá)015m),清楚度很好,亦合適作細(xì)胞學(xué)

2、研究,并能夠制成連續(xù)切片,制片易于長遠(yuǎn)保留,易于溝通等。但制片周期較長,易受條件限制,制片中使用化學(xué)試劑許多,對人有必定迫害,易使資料變脆、變硬或變形,某些內(nèi)含物易于消逝,常使組織變小,甚至使組織扭轉(zhuǎn)變形,細(xì)胞所含物質(zhì)減小而折光性加強(qiáng),影響察看正確性,且制片成本較高等。一、植物組織制片技術(shù)的概括植物組織制片技術(shù)是跟著顯微鏡的出現(xiàn)而發(fā)展起來的技術(shù)，令人們認(rèn)識植物體結(jié)構(gòu)的有效手段，已成為植物生物學(xué)的重要構(gòu)成部分1。切片技術(shù)是生物科學(xué)工作者特別是植物學(xué)工作者常用的一種實(shí)驗(yàn)手段。跟著各樣新儀器的問世和新技術(shù)方法的不停成立與使用，白臘切片技術(shù)也漸漸擴(kuò)展、滲透很多新領(lǐng)域中，做為基礎(chǔ)技術(shù)供給有效的實(shí)驗(yàn)或使用

3、樣品。白臘包埋組織切片還可用于細(xì)胞原位核酸分子雜交技術(shù)中，可對資猜中被雜交的DNA分子進(jìn)行定位、含量剖析或察看基因表達(dá)（mRNA）水平；聚合酶鏈?zhǔn)椒错懀≒CR）技術(shù)可用于固定、白臘包埋組織的DNA剖析，使研究進(jìn)入了分子水平，但在短期內(nèi)這些技術(shù)尚不可以做慣例使用2。1/8迄今為止,植物制片技術(shù)已成立了很多方法，多采納的有徒手切片法、滑走切片法、離析法、壓片法、白臘切片法等3，此中最慣例的為白臘切片法。但是采納慣例白臘切片法包埋及染色所需的時(shí)間太長、太繁瑣，有些質(zhì)地過硬的資料也不宜使用。本研究相同采納此方法，并在方法長進(jìn)行了一些改進(jìn)，其周期短成為該法的明顯特色，8-10天即可達(dá)成整個(gè)制片過程，同時(shí)

4、還節(jié)儉了試劑6。二、實(shí)驗(yàn)用具與試劑21用具白臘切片機(jī)、烘箱、切片刀、恒溫展片臺、蠟杯、酒盅若干、酒精燈、蠟鏟、顯微鏡、染色缸、小培育皿、鑷子、臺木、樹膠、臉盆、包埋紙盒、吸管、毛筆、吸水紙、紗布、載玻片、蓋玻片等。22試劑1%番紅、1%固綠、各濃度的酒精（無水乙醇、95%、85%、80%、70%、50%、30%）、FAA固定液、二甲苯、白臘、埃利希蘇木精染液、郝普特氏粘片劑、蒸餾水、中性樹膠等。實(shí)驗(yàn)資料選擇植物健康、標(biāo)準(zhǔn)、具代表性的部分4。假如不是為了特別目的，不可以用一些病態(tài)的不正常的資料。采下的資料應(yīng)趕快浸入固定液固定。本實(shí)驗(yàn)采納幾種針茅（Stipa.）的葉片進(jìn)行白臘制片，資料直徑1mm左

5、右，長0.8-1.0cm。實(shí)驗(yàn)步驟41固定所截獲得資料應(yīng)快速投入固定液。選擇固定液的原則就是用藥品把細(xì)胞殺死，使細(xì)胞的原生質(zhì)凝結(jié)，死后不發(fā)生變化，盡可能保持本來的結(jié)構(gòu)以供我們2/8察看。優(yōu)秀的固定劑，應(yīng)是穿透力強(qiáng)，使細(xì)胞馬上致死，原生質(zhì)所有凝結(jié)；不發(fā)生任何變形，加強(qiáng)折光率，并且不阻礙染色。所以植物資料不一樣，應(yīng)選擇不同的固定液。我們選擇FAA固定液對針茅葉片進(jìn)行固定，F(xiàn)AA固定液是最常用的一種固定液，其用量最少應(yīng)為所固定資料的整體積的20倍，應(yīng)當(dāng)使植物資料周圍都能浸泡在固定液里，這樣能在短時(shí)間里使固定液浸透資料。植物資料固定后，若不馬上制片，能夠保留在固定液中，或轉(zhuǎn)至70%酒精溶液中保留7。4

6、2脫水及透明將資料從固定液中拿出后，進(jìn)行植物資料脫水，其詳細(xì)流程以下：A：酒精X：二甲苯70%A（2h）70%A(2h)70%A（2h）80%A（留宿）85%A（2h）95%A+伊紅（2h）100%A（1h）100%A（1h）（1h）（1h）X（1h）X（1h）。設(shè)置濃度梯度是為了防備資料皺縮，但詳細(xì)濃度梯度和浸泡時(shí)間要視資料狀況而定，對于幼嫩的資料，梯度要大些，各步浸泡時(shí)間可短些，老的硬的梯度則要小些，各步浸泡時(shí)間則相應(yīng)要長些。第二次100A脫水很重點(diǎn)，必定要保證水脫盡。43滲蠟將透明的資料用鑷子拿出放進(jìn)蠟杯中，再把碎白臘（熔點(diǎn)48-50）用蠟鏟放到蠟杯為止，加蓋放入37溫箱，擱置24h進(jìn)行

7、溶蠟。24小時(shí)后去掉蠟杯的蓋子，以后再將溫箱溫度調(diào)至56擱置5天，使其透明劑充分揮發(fā)。取若干個(gè)酒盅將資料轉(zhuǎn)移至盛有熔點(diǎn)為60-62白臘的酒盅里，溫箱溫度調(diào)到70，2h換一次熔點(diǎn)60-62的白臘，換三次即可進(jìn)入包埋程序。4.4包埋4.4.1折包埋紙盒包埋前應(yīng)先準(zhǔn)備包埋用的紙盒。紙盒用較硬而圓滑的紙折成，大小依據(jù)植物資料的大小而定，這里用6cm1cm1cm的紙盒。3/84.4.2植物資料包埋將純白臘倒入小紙盒，用加熱的鑷子快速把資料按需要的切面和必定的間隔擺列齊整并使其豎直，進(jìn)行包埋5。略微凝結(jié)后倒置于清水盆中完全冷卻凝結(jié)。在慣例白臘包埋中最困難的是碎小組織、纖細(xì)葉片的包埋，能夠在紙盒里倒入少量的

8、白臘，是資料基部固定住后，再倒白臘至完整覆遮住資料。4.5修蠟將包埋好的資料從擺賣紙盒里拖出蠟塊，用雙面刀片切割成小塊，刀片不宜太厚，免得資料從蠟塊中零落。每個(gè)小塊包括一個(gè)資料，并修成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形對邊平行，梯形底部用燒熱的蠟鏟將其固定在木臺（2cm2cm2.53cm）上，植物資料的切面與木臺的粘貼面平行。4.6切片將粘有蠟塊的小木塊至于切片機(jī)上固定，調(diào)整切距到合適大小，轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)理器調(diào)切片厚度8m進(jìn)行切片。注意切片刻要一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，另一手執(zhí)毛筆將切下來的片子攤開以形成一長條蠟帶。切片過程中，假如蠟帶傾向一邊，也要實(shí)時(shí)修正蠟塊，進(jìn)而保證切片的連續(xù)性。4.7粘片及烘片滴一滴粘

9、片劑于潔凈載玻片中央，用潔凈的擦鏡紙涂抹平均后，滴上蒸餾水，將取下的具代表性的蠟帶切成小段置于載玻片上（放上四至五段），而后將載玻片放到恒溫展片臺上(保持40)燙片。待充分燙平后將其移至邊沿試玻片上的水分充分烘干。以后將切片擱置15天自然晾干或代替為31溫箱烘干一天。燙片刻要注意掌握時(shí)間，不可以燙片過分，但要保證充分燙平。4.8脫蠟及染色將玻片標(biāo)本放于切片框里待進(jìn)行脫蠟于染色步驟，詳細(xì)步驟如過一下)85%A(過一下)50%A（過一下）30%A（過一下)1%番紅溶液(4h)蒸餾4/8水（快速）50%A+HCI（快速）95%A+氨水（快速）1%固綠（95%A配制）(30s)95%A(1min)10

10、0%A(過一下)100%A(過一下）50%X+50%A(過一下)100%X(過一下)100%X(過一下)。注意番紅染色時(shí)間要長些（起碼3h以上），隨后的兩次經(jīng)過酒精的時(shí)間都應(yīng)很短，免得洗掉染上的番紅，固綠的染色時(shí)間大概在20-30s，均要視詳細(xì)狀況而定。4.9封片從二甲苯中拿出然好色的片子，用中性樹膠進(jìn)行封片。醬油植物切片的玻片平置于實(shí)驗(yàn)臺上，在上邊滴一滴樹膠于玻片中央地點(diǎn)，使其慢慢向外溢，用鑷子取干燥的或浸在75%乙醇中的蓋玻片，從植物切片的一側(cè)呈一傾斜的角度接觸樹膠，慢慢蓋上，待整個(gè)蓋玻片的內(nèi)表面所有接觸樹膠后，用鑷子輕輕蓋壓玻片，趕出切片中的氣泡，并使樹膠曾盡可能薄而平均。注意封片用的該

11、玻片要潔凈，封片刻要注意不要產(chǎn)生氣泡。三、白臘切片制作中的問題與解決白臘切片是當(dāng)前各樣切片制作方法中最廣泛應(yīng)用的一種方法。優(yōu)良切片的標(biāo)準(zhǔn)是切片要平坦、無刀口、無劃痕、無皺褶,染色鮮亮、清楚,紅藍(lán)比較顯然。但制作白臘切片程序許多,步驟復(fù)雜,不論哪個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題,都會(huì)影響切片整體質(zhì)量。影響切片質(zhì)量的要素好多:1、脫水脫水過程中出現(xiàn)的問題主假如脫水不凈和過分硬化,脫水不凈時(shí)二甲苯不可以滲透,蠟液不可以滲透組織,可致使切片困難,切出的片子在染色時(shí)易脫片。而組織蠟塊與空氣接觸后也會(huì)因水分蒸發(fā)而凸陷,故脫水時(shí)必定要保證脫水液濃度達(dá)標(biāo),常常改換新液,遇脂肪組織或松散的纖維組織宜加長脫水時(shí)間。組織在純?yōu)⒕蟹?/p>

12、置的時(shí)間也不可以過久,不然會(huì)造成過分硬化,此外為防備組織過硬,對于比較嬌嫩的組織,其開端的脫水灑精濃度可低于70%8。2、透明二甲苯是最常有的透明劑,但其縮短性強(qiáng),極易使組織變脆,故在這一過程中要嚴(yán)加控制,一般30分鐘便可達(dá)到透明的程度,但溫度較低時(shí)可合適延伸時(shí)間或置5/8于溫箱中加熱,此外在透明過程中還要注意改換二甲苯,有時(shí)甚至改換二、三次以上,每次10分鐘左右,如二甲苯為舊液體,應(yīng)選擇多的改換次數(shù)。3、浸蠟、包埋浸蠟和包埋要一次達(dá)成,要盡量在恒溫下操作,防備中間出現(xiàn)溫度差,蠟的溫度要適合,不可以過高使組織燙壞或使碎小組織變脆,變硬,也不可以溫度過低使組織與白臘離開,蠟塊中不可以出現(xiàn)氣泡、裂

13、隙,斑點(diǎn),對于碎小組織要盡可能使其處于同一平面,不然會(huì)造成切片不全與漏切,此時(shí)要盡可能使碎小組織下沉,并防備其重疊。4、切片手工切片刻,使勁要平均一致,不宜過重過猛,簡單造成切片厚薄不均,甚至破壞蠟塊。在夏天切片刻,為保持蠟塊硬度,可把蠟塊放于冰柜中,切時(shí)拿出,組織蠟塊周圍在切片前應(yīng)修齊,大小合適,切片機(jī)要放穩(wěn),不可以震動(dòng),切片刀要置好,傾斜角要大小適合,一般以2030為宜9。5、染色染色過程中出現(xiàn)的老是許多,除了要防備染色成效不好外,還要注意不可以脫水。為此第一要注意染色液的配制濃度要正確,PH值要合適,且不可以有積淀。染色前切片脫蠟要完全。染色時(shí)間要依據(jù)染液的新舊合適調(diào)整,必需時(shí)在染色過程

14、頂用顯微鏡察看,染色過程中防止陽光照耀。防備脫片的主要舉措有:載玻片要清洗潔凈,切片貼附時(shí),水溫要足夠,使切片與玻片貼緊,貼附以后不宜馬上染色要烤干。染色過程中,水沖刷不宜太猛。6、封固切片封固不良,易出現(xiàn)色素顆粒、氣泡、云霧狀物等,其原由大概為:封固時(shí)二甲苯已揮發(fā)完成,封固劑過稀,切片厚薄不勻,切片未睜開,封固方法不妥,組織脫水不凈等,故在封固前,當(dāng)二甲苯揮發(fā)后,應(yīng)從頭放入到二甲苯中透明,封固劑要濃度合適,封固時(shí)先將蓋玻片一側(cè)擱置于滴有樹膠的組織切片上,而后遲緩放下將空氣完整清除,封固時(shí)防止水蒸氣進(jìn)入10。6/8我以為制作優(yōu)良切片的重點(diǎn)在于責(zé)任心,假如每一個(gè)人每天都能真實(shí)做到身臨其境為患者著想,嚴(yán)格恪守操作規(guī)程,慣例白臘切片的質(zhì)量必定會(huì)愈來愈好。參照文件:1王明書，孫敏，白志川.結(jié)構(gòu)植物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)M.西南師范大學(xué)第一版社，2003.2黃南平.N-烷基-己內(nèi)酰胺的合成及其在植物資料染色中的應(yīng)用J.江西科學(xué)，2003，211）：6466.3榮偉，劉海燕.對于白臘切片在染色中脫蠟的商討J.解剖學(xué)雜志，200629（1）：91.4葉創(chuàng)興，馮虎元，等.植物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)M.清華大學(xué)第一版社，2006.5何鳳仙，主